अरबीडोप्सिस में ऑस्मोटिक स्ट्रेस सिग्नलिंग के लिए फॉस्फोप्रोटेओमिक रणनीति
Summary
यहां प्रस्तुत एक फॉस्फोप्रोटेओमिक दृष्टिकोण है, अर्थात् स्टॉप एंड गो एक्सट्रैक्टिंग टिप आधारित फॉस्फोप्रोटेओमिक, जो अरबीडोप्सिस फॉस्फोप्रोटेम के उच्च-थ्रूपुट और डीप कवरेज प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण अरबीडोप्सिस में ऑस्मोटिक तनाव सिग्नलिंग के अवलोकन को चित्रित करता है।
Abstract
प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन ऑस्मोटिक स्थिति के तहत एंजाइम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति के नियमन के लिए महत्वपूर्ण है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित फॉस्फोप्रोटेओमिक्स ने पौधों के सिग्नल ट्रांसडक्शन का अध्ययन करने का तरीका बदल दिया है। हालांकि, कवरेज की गहराई को प्राप्त करने के लिए बहुत सारी सामग्रियों और लंबे समय तक एमएस माप समय की आवश्यकता पौधों में वैश्विक फॉस्फोप्रोटेओमिक परिवर्तनों के उच्च थ्रूपुट अध्ययन के लिए सीमित कारक रही है। पौधे फॉस्फोप्रोटेओमिक्स की संवेदनशीलता और थ्रूपुट में सुधार करने के लिए, हमने ऑस्मोटिक तनाव के जवाब में पौधे फॉस्फोरिलेशन क्षोभ के तेजी से और व्यापक विश्लेषण के लिए टैंडेम मास टैग (टीएमटी) लेबलिंग के साथ मिलकर एक स्टॉप एंड गो एक्सट्रैक्टेशन (स्टेज) टिप आधारित फॉस्फोप्रोटेमिक्स दृष्टिकोण विकसित किया है। चरण टिप तकनीक की सादगी और उच्च थ्रूपुट का लाभ उठाते हुए, पूरी प्रक्रिया में फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन, अंश और नमूना सफाई चरणों को खत्म करने के लिए दो युक्तियों का उपयोग करके लगभग एक घंटे लगते हैं, जो दृष्टिकोण की आसान-से-उपयोग और उच्च दक्षता का सुझाव देते हैं। यह दृष्टिकोण न केवल एक गहन संयंत्र फॉस्फोप्रोटेमिक्स विश्लेषण (> 11,000 फॉस्फोपेप्टाइड पहचान) प्रदान करता है, बल्कि निकटवर्ती अंशों के बीच बेहतर पृथक्करण दक्षता (< 5% ओवरलैप) को भी दर्शाता है। इसके अलावा, वाइल्ड-टाइप और snrk2 डिकुपल म्यूटेंट पौधों के फॉस्फोप्रोटेमोमिक बदलावों की मात्रा निर्धारित करने के लिए टीएमटी लेबलिंग का उपयोग करके मल्टीप्लेक्सिंग हासिल की गई है । इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग ओस्मोटिक तनाव के जवाब में आरएएफ जैसी किनेस की फॉस्फोरिलेशन घटनाओं को प्रकट करने के लिए किया गया है, जो भूमि संयंत्रों में प्रारंभिक ऑस्मोटिक सिग्नलिंग की समझ पर प्रकाश डालता है।
Introduction
उच्च लवणता, कम तापमान, और सूखे के कारण ओस्मोटिक तनाव होता है, जो एक प्रमुख पर्यावरणीय कारक है जो पौधों की उत्पादकता को प्रभावित करता है1,2। प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन सबसे महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में से एकहै जो ओस्मोटिक तनाव3,4,5के पौधे के जवाब में संकेत धारणा और लेनदेन मध्यस्थता करता है। SNF1 से संबंधित प्रोटीन kinase 2s (SnRK2s) ऑस्मोटिक तनाव संकेत6में शामिल हैं । एसएनआरके2 परिवार के दस में से नौ सदस्य ों में ऑस्मोटिक स्ट्रेस7,8के जवाब में महत्वपूर्ण सक्रियता दिखाई दे रही है . snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)उत्परिवर्ती सभी दस SnRK2 में उत्परिवर्तन होने ओस्मोटिक तनाव के लिए अतिसंवेदनशीलता प्रदर्शित किया । snrk2-dec उत्परिवर्ती में, इनोसिटोल 1,4,5-ट्राइस्फोस्फेट (आईपी3),एब्सिसिक एसिड (एबीए) बायोसिंथेसिस, और जीन अभिव्यक्ति दृढ़ता से कम कर रहे हैं, ओस्मोटिक तनाव प्रतिक्रियाओं में SnRK2s की महत्वपूर्ण भूमिका को उजागर6के ऑस्मोटिक तनाव-प्रेरित संचय । हालांकि, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि SnRK2s kinases इन जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित कैसे । ऑस्मोटिक तनाव के जवाब में फॉस्फोप्रोटेओमिक परिवर्तनों की प्रोफाइलिंग इस अंतर को पाटने और पौधों में ऑस्मोटिक तनाव-ट्रिगर रक्षा तंत्र को चित्रित करने का एक कुशल तरीका है।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) मैपिंग प्लांट फॉस्फोप्रोटेम9के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। हालांकि, पौधे फॉस्फोप्रोटेओमिक्स का लक्षण वर्णन, पौधे प्रोटेम की गतिशील रेंज और पौधों की जटिलता4के कारण एक चुनौती बनी हुई है। इन चुनौतियों से उबरने के लिए, हमने एक सार्वभौमिक संयंत्र फॉस्फोप्रोटेओमिक वर्कफ्लो विकसित किया, जो फोटोसिंथेटिक पिगमेंट और माध्यमिक मेटाबोलाइट्स जैसे अवांछित हस्तक्षेपों को समाप्त करता है, और पौधे फॉस्फोप्रोटेम10के गहरे कवरेज को सक्षम करता है। एमएस विश्लेषण 11 ,12 , 13 , 14 , 15,16से पहले फॉस्फोपेप्टाइड्स को समृद्ध करने के लिए स्थिर धातु आयन एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) और धातु ऑक्साइड क्रोमेटोग्राफी (एमओसी) जैसे कई फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन विधी विकसित की गई हैं । फॉस्फोपेप्टाइड्स के साथ सह-शुद्ध अम्लीय गैर-फॉस्फोपेप्टाइड फॉस्फोपेप्टाइड का पता लगाने के लिए प्रमुख हस्तक्षेप हैं। पहले, हमने प्री-फ्रैक्शन चरण11को दरकिनार करते हुए 90% से अधिक संवर्धन विशिष्टता प्राप्त करने के लिए, गैर-फॉस्फोपेप्टाइड्स के बंधन को खत्म करने के लिए आईमैक लोडिंग बफर के पीएच मूल्य और कार्बनिक एसिड एकाग्रता को मानकीकृत किया।
फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन और अंश की बहु-चरण प्रक्रिया में नमूना हानि फॉस्फोपेप्टाइड पहचान की संवेदनशीलता और फॉस्फोप्रोटेडोमिक कवरेज की गहराई को बाधित करती है। स्टॉप-एंड-गो-एक्सट्रैक्टिंग टिप्स (स्टेज टिप्स) पिपेट टिप्स हैं जिनमें टिप के अंत को सीमित करने के लिए छोटे डिस्क होते हैं, जिन्हें पेप्टाइड आंशिकता और सफाई17के लिए क्रोमेटोग्राफी के साथ शामिल किया जा सकता है। चरण टिप प्रक्रिया के दौरान नमूना हानि ट्यूबों के बीच नमूना हस्तांतरण से बचने के द्वारा कम किया जा सकता है। हमने जीए3 + –आईमैक और फे3 +-आईमैक में स्टेज टिप को सफलतापूर्वक लागू किया है ताकि कम प्रचुर मात्रा में कई फॉस्फोरिलेटेड पेप्टाइड्स को अकेले फॉस्फोरिलेटेड पेप्टाइड्स से अलग किया जा सके, जिससे मानव फॉस्फोप्रोटेम15की गहराई में सुधार हुआ। इसके अलावा, उच्च पीएच रिवर्स-फेज (एचपी-आरपी) चरण टिप के उपयोग ने मजबूत आयन एक्सचेंज (एससीएक्स) और मजबूत एनियन एक्सचेंज (एसएक्स) क्रोमेटोग्राफी18की तुलना में मानव झिल्ली प्रोटेम के व्यापक कवरेज का प्रदर्शन किया है। इसलिए, आईमैक और एचपी-आरपी स्टेज टिप तकनीकों को एकीकृत करने से सादगी, उच्च विशिष्टता और उच्च थ्रूपुट के साथ पौधे फॉस्फोप्रोटेम कवरेज में वृद्धि हो सकती है। हमने दिखा दिया है कि इस रणनीति ने अरबीडोप्सिस रोपण से 20,000 से अधिक फॉस्फोरिलेशन साइटों की पहचान की, जो पौधे फॉस्फोप्रोटेम19की बढ़ी हुई गहराई का प्रतिनिधित्व करती है।
यहां, हम अरबीडोप्सिस में फॉस्फोप्रोटेओमिक प्रोफाइलिंग के लिए एक चरण टिप-आधारित फॉस्फोप्रोटेओमिक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। यह कार्यप्रवाह ऑस्मोटिक तनाव के जवाब में जंगली प्रकार और snrk2-dec उत्परिवर्ती रोपण के फॉस्फोप्रोटेओमिक क्षोभ का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। फॉस्फोप्रोटेओमिक विश्लेषण से किनेस एक्टिवेशन और अर्ली ऑस्मोटिक स्ट्रेस सिग्नलिंग में फंसा फॉस्फोरिलेशन साइट्स का पता चला । जंगली प्रकार और snrk2-dec उत्परिवर्ती फॉस्फोप्रोटेम डेटा के तुलनात्मक विश्लेषण ने आरएएफ की तरह किनेज़ (आरएएफ) की खोज का नेतृत्व किया-SnRK2 kinase झरना जो उच्च पौधों में ओसमोर तनाव संकेत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पौधे प्रोटेम और फॉस्फोप्रोटेम की गतिशील सीमा और जटिलता अभी भी फॉस्फोप्रोटेमिक्स विश्लेषणों की गहराई तक एक सीमित कारक है। 10,000 फॉस्फोरिलेशन साइटों21, 22की पहचान करने के लिए एकल रन एल…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज, ग्रांट XDB27040106 के स्ट्रैटेजिक प्रायोरिटी रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया ।
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Referências
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