Arabidopsis'te Osmotik Stres Sinyali Profili Çıkarmak için Fosfoproteomik Strateji
Summary
Burada sunulan fosfoproteomik bir yaklaşımdır, yani arabidopsis fosfoproteomun yüksek verimli ve derin kapsamasını sağlayan dur ve git ekstraksiyon ucu bazlı fosfoproteomik. Bu yaklaşım Arabidopsis’te ozmotik stres sinyaline genel bakışı tanımlamaktedir.
Abstract
Protein fosforilasyonu, ozmotik durum altında enzim aktivitesinin ve gen ekspresyonunun düzenlenmesi için çok önemlidir. Kütle spektrometresi (MS) bazlı fosfoproteomik, bitki sinyali transdüksiyonunu inceleme şeklini dönüştürmüştür. Bununla birlikte, kapsama derinliğini elde etmek için çok sayıda başlangıç malzemesinin ve uzun ms ölçüm süresinin gerekliliği, bitkilerdeki küresel fosfoproteomik değişikliklerin yüksek verimli çalışması için sınırlayıcı faktör olmuştur. Bitki fosfoproteomiklerinin hassasiyetini ve verimini artırmak için, ozmotik strese yanıt olarak bitki fosforilasyon pertürbasyonunun hızlı ve kapsamlı analizi için Tandem Mass Tag (TMT) etiketlemesi ile birlikte dur ve git ekstraksiyonu (aşama) uç bazlı fosfoproteomik yaklaşım geliştirdik. Sahne ucu tekniğinin basitliğinden ve yüksek veriminden yararlanan tüm prosedür, fosfopenptid zenginleştirme, fraksiyonasyon ve numune temizleme adımlarını bitirmek için iki ipucu kullanarak yaklaşık bir saat sürer ve bu da yaklaşımın kullanımı kolay ve yüksek verimliliğini önerir. Bu yaklaşım sadece derinlemesine bir bitki fosfoproteomik analizi (> 11.000 fosfopenptid tanımlaması) sağlamaz, aynı zamanda bitişik kesirler arasındaki üstün ayırma verimliliğini (< % 5 örtüşme) gösterir. Ayrıca, vahşi tip ve snrk2 mutant bitkilerinin fosfoproteomik değişikliklerini ölçmek için TMT etiketlemesi kullanılarak çoklama sağlanmıştır. Bu yaklaşım, kara bitkilerinde erken ozmotik sinyalizasyonun anlaşılmasına ışık tutan ozmotik strese yanıt olarak Raf benzeri kinazların fosforilasyon olaylarını ortaya çıkarmak için başarıyla kullanılmıştır.
Introduction
Yüksek tuzluluk, düşük sıcaklık ve kuraklık, bitki verimliliğini etkileyen önemli bir çevresel faktör olan ozmotik streslere neden olur1,2. Protein fosforilasyonu, osmotik strese santral tepkisinde sinyal algısına ve transdüksiyona aracılık eden çeviri sonrası en önemli modifikasyonlardan biridir3,4,5. SNF1 ile ilgili protein kinaz 2’ler (SnRK2s) ozmotik stres sinyalinde yer almaktadır6. SnRK2 ailesinin on üyesinden dokuzu ozmotik strese yanıt olarak önemli aktivasyon gösterir7,8. On SnRK2’nin tamamında mutasyona uğrayan snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant ozmotik strese karşı aşırı duyarlılık gösterdi. Snrk2-dec mutantında, inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscisic asit (ABA) biyosentezinin ozmotik stres kaynaklı birikimi ve gen ifadeleri güçlü bir şekilde azalır ve SnRK2’lerin ozmotik stres yanıtlarındaki hayati rolünü vurgular6. Bununla birlikte, SnRK2s kinazlarının bu biyolojik süreçleri nasıl düzenlediği hala belirsizdir. Osmotik strese yanıt olarak fosfoproteomik değişikliklerin profillenmesi, bu boşluğu kapatmanın ve bitkilerdeki ozmotik stresi tetikleyen savunma mekanizmalarını tanımlamanın etkili bir yoludur.
Kütle spektrometresi (MS), bitki fosfoproteom9’unharitalandırılması için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, bitki fosfoproteomiklerinin karakterizasyonu, bitki proteomunun dinamik aralığı ve bitki lysate4’ünkarmaşıklığı nedeniyle bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, fototiretik pigmentler ve ikincil metabolitler gibi istenmeyen parazitleri ortadan tanıyan ve bitki fosfoproteomunun derin kapsamasını sağlayan evrensel bir bitki fosfoproteomik iş akışı geliştirdik10. MS analizi 11,12,13,14,15,16öncesinde fosfopenptidlerin zenginleştirilmesi için hareketsiz metal iyonbenzeşim kromatografisi (IMAC) ve metal oksit kromatografisi (MOC) gibi çeşitli fosfopenptid zenginleştirme yöntemleri geliştirilmiştir. Fosfopenptitlerle birlikte saflaştırıcı asidik fosfopenptitler fosfopenptid tespiti için başlıca girişimlerdir. Daha önce, fosfopenptitlerin bağlanmasını ortadan kaldırmak, ön fraksiyonasyon adım11’iatlayarak% 90’dan fazla zenginleştirme özgüllüğü elde etmek için IMAC yükleme tamponunun pH değerini ve organik asit konsantrasyonunu standartlaştırdık.
Fosfopenptid zenginleştirme ve fraksiyonasyonun çok adımlı sürecindeki numune kaybı fosfopenptid tanımlama hassasiyetini ve fosfoproteomik kapsamın derinliğini engeller. Durdur ve git ekstraksiyon ipuçları (aşama ipuçları), peptit fraksiyonasyonu ve temizliği için kromatografi ile birleştirilebilen ucun ucunu kaplamak için küçük diskler içeren pipet uçlarıdır17. Tüpler arasında numune aktarımı önlenerek kademe ucu işlemi sırasında numune kaybı en aza indirilebilir. Ga3+-IMAC ve Fe3+-IMAC’de, insan fosfoproteomunun derinliğini artıran tekil fosforilasyonlu peptitlerden düşük bol çoklu fosforillenmiş peptitleri ayırmak için aşama ipucunu başarıyla uyguladık15. Ek olarak, yüksek pH ters fazlı (Hp-RP) faz ucunun kullanımı, güçlü katyon değişimi (SCX) ve güçlü anion değişimi (SAX) kromatografisi18ile karşılaştırıldığında insan zarı proteomunun daha geniş kapsamını göstermiştir. Bu nedenle, IMAC ve Hp-RP kademe ucu tekniklerini entegre etmek, bitki fosfoproteom kapsamını basitlik, yüksek özgüllük ve yüksek verim ile artırabilir. Bu stratejinin Arabidopsis fidelerinden 20.000’den fazla fosforilasyon alanı tanımladığını ve bitki fosfoproteomunun gelişmiş bir derinliğini temsil ettiğini gösterdik19.
Burada, Arabidopsis’te fosfoproteomik profilleme için aşama ucu tabanlı fosfoproteomik bir protokol bildiriyoruz. Bu iş akışı, ozmotik strese yanıt olarak vahşi tip ve snrk2-dec mutant fidelerinin fosfoproteomik pertürbasyonunu incelemek için uygulanmıştır. Fosfoproteomik analiz, kinaz aktivasyonu ve erken ozmotik stres sinyali ile ilişkili fosforilasyon bölgelerini ortaya çıkardı. Vahşi tip ve snrk2-dec mutant fosfoproteome verilerinin karşılaştırmalı analizi, yüksek bitkilerde osmore stres sinyallerinde kilit rol oynayan Raf benzeri bir kinaz (RAF)-SnRK2 kinaz kaskadının keşfine yol açtı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bitki proteomunun dinamik aralığı ve karmaşıklığı ve fosfoproteom hala fosfoproteomik analizlerin derinliği için sınırlayıcı bir faktördür. 10.000 fosforilasyon bölgesi21 , 22‘yitanımlamak için tek çalıştırmalı LC-MS / MS analizi yeteneğine rağmen, tüm bitki fosfoproteomunun kapsamı hala sınırlıdır. Bu nedenle, çevresel strese yanıt olarak tesis sinyal ağlarının küresel görünümünün profil oluşturmasında yüksek hassasi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı Grant XDB27040106 tarafından desteklendi.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Referências
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
