Estratégia fosfoproteômica para traçar sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis

Resumo

Apresentada aqui é uma abordagem fosfoproteômica, ou seja, parar e ir extração baseada em fosfoproteômica, que fornece alta produtividade e cobertura profunda de fosfoproteome arabidopsis. Esta abordagem delineia a visão geral da sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis.

Resumo

A fosforilação proteica é crucial para a regulação da atividade enzimática e expressão genética sob condição osmótica. A espectrometria de massa (masfoproteômica baseada em MS) transformou a maneira de estudar a transdução de sinal vegetal. No entanto, a exigência de muitos materiais iniciais e tempo de medição prolongado de MS para alcançar a profundidade da cobertura tem sido o fator limitante para o estudo de alto rendimento das mudanças fosfoproteômicas globais nas plantas. Para melhorar a sensibilidade e o throughput da fosfoproteômica vegetal, desenvolvemos uma abordagem de fosfoproteômica baseada em ponta (estágio) em conjunto com a rotulagem tandem mass tag (TMT) para a análise rápida e abrangente da perturbação da fosforilação vegetal em resposta ao estresse osmótico. Aproveitando a simplicidade e o alto rendimento da técnica de ponta de palco, todo o procedimento leva aproximadamente uma hora usando duas dicas para finalizar o enriquecimento de fosforpecida, fracionamento e etapas de limpeza de amostras, sugerindo uma facilidade de uso e alta eficiência da abordagem. Essa abordagem não só fornece uma análise de fosfoproteômica vegetal aprofundada (> 11.000 identificação de fosfopeptídeo), mas também demonstra a eficiência de separação superior (< 5% sobreposição) entre frações adjacentes. Além disso, o multiplexing foi alcançado usando rotulagem TMT para quantificar as alterações fosfoproteômicas de plantas mutantes desocuple tipo selvagem e snrk2. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para revelar os eventos de fosforilação de cinesases semelhantes a Raf em resposta ao estresse osmótico, que lança luz sobre a compreensão da sinalização osmótica precoce em plantas terrestres.

Introdução

Alta salinidade, baixa temperatura e seca causam estresses osmóticos, que é um dos principais fatores ambientais que afetam a produtividade das plantas^1,2. A fosforilação proteica é uma das modificações pós-translacionais mais significativas que mediam a percepção e transdução do sinal na resposta vegetal ao estresse osmótico^3,4,5. A proteína quinase 2s (SnRK2s) relacionada ao SNF1 está envolvida na sinalização de estresse osmótico⁶. Nove dos dez membros da família SnRK2 mostram ativação signif....

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Colher as mudas tratadas de controle e estresse (1 g) em uma folha de alumínio e congelar as amostras em nitrogênio líquido.
   NOTA: A maior concentração de proteínas é geralmente observada a partir de mudas de duas semanas de idade do que as de plantas maduras. Um grama de mudas gera aproximadamente 10 mg de proteína lysate, o que é suficiente para a análise de MS. Todas as etapas de centrifugação ocorrem a 16.000 x g na etapa 1.
2. Triture mudas congeladas em pó fino usando uma argamassa e pilão cheias de nitrogênio líquido.
3. Adicionar 1 mL de tampão de lise ((6 M guanidina-HCl em 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) ....

Resultados

Para demonstrar o desempenho deste fluxo de trabalho, exploramos a ponta de palco do IMAC juntamente com o fracionamento da ponta do estágio Hp-RP para medir as mudanças fosfoproteômicas em mudas mutantes de tipo selvagem e snrk2-dec com ou sem tratamento mannitol por 30 minutos. Cada amostra foi realizada em triplicados biológicos, e o fluxo de trabalho experimental está representado na Figura 1. Os peptídeos digeridos (400 μg) de cada amostra foram rotulados com um canal TMT-6plex.......

Discussão

O alcance dinâmico e a complexidade do proteome vegetal e do fosfoproteome ainda são um fator limitante à profundidade das análises fosfoproteômicas. Apesar da capacidade de análise lc-MS/MS de execução única para identificar 10.000 locais de fosforilação^21,22, a cobertura de todo o fosfoproteome vegetal ainda é limitada. Portanto, é necessário um fluxo de trabalho fosfoproteômico que ofereça alta sensibilidade e eficiência de separação superior no perfil da visã.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de 1,5 mL	eppendorf	22431081	Protein LoBind, 1,5 mL, PCR limpo, incolor, 100 tubos
200 µ Ponta de pipeta L	Gilson	F1739311
2-cloroacetamida	Sigma-Aldrich	C0267
ácido acético	Sigma-Aldrich	5438080100
acetonitrila	Sigma-Aldrich	hidróxido de
	Sigma-Aldrich 338818
fosfato de amônio monbasic	Sigma-Aldrich	216003
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Thermo Fisher Scientific	23227
agulha de ponta romba	Hamilton	90516	Kel-F hub (KF), estilo de ponta 3, calibre 16
contas C18-AQ	Dr. Maisch	ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µ m
C8 Empore disk	3 M	2214	47 mm
Centrífuga	eppendorf	22620444
clorofórmio	Sigma-Aldrich	CX1058
		de análise de dados	Perseus 1.6.2.1
ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma-Aldrich
fórmico ácido	Sigma-Aldrich	5330020050
fritas	Agilent	12131024	fritas para cartuchos SPE
Cloridrato de guanidina	Sigma-Aldrich	50933
H2O	Sigma-Aldrich	1153334000
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloreto de ferro (III)	Sigma-Aldrich	157740
LTQ-orbitrap	Thermo Fisher Scientific	Velos Pro
espectrômetro de massa	Thermo Fisher Scientific	LTQ-Orbitrap Velos Pro
metanol	Sigma-Aldrich	34860
nano LC	Thermo Fisher Scientific	Easy-nLC 1000
Ni-NTA coluna de rotação	Qiagen	31014
N-Lauroilsarcosina sal de sódio	Sigma-Aldrich	L9150
êmbolo	Hamilton	1122-01	Conjunto de êmbolo N, RN, LT, LTN para modelo 1702 (25 μ l)
	de mecanismo de pesquisa	MaxQuant 1.5.4.1	https://www.maxquant.org
SEP-PAK Cartucho 50 mg	Águas	WAT054960
desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	D6750
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific	SPD121P
TMT 6-plex	Thermo Fisher Scientific	90061
Tampão de bicarbonato de trietilamônio	Sigma-Aldrich	T7408
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	91707
Cloridrato de tris (2-carboxietil) fosfina	Sigma-Aldrich	C4706
Cloridrato de Trizma	Sigma-Aldrich	T3253

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