Estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis
Summary
Aquí se presenta un enfoque fosfoproteómico, a saber, detener e ir extracción a base de punta fosfoproteómica, que proporciona alto rendimiento y cobertura profunda de arabidopsis fosfoproteoma. Este enfoque delinea la visión general de la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis.
Abstract
La fosforilación proteica es crucial para la regulación de la actividad enzimática y la expresión génica en condiciones osmóticas. La espectrometría de masas (EM) basada en la fosfoproteómica ha transformado la forma de estudiar la transducción de la señal vegetal. Sin embargo, el requisito de una gran cantidad de materiales de partida y el tiempo prolongado de medición de EM para lograr la profundidad de cobertura ha sido el factor limitante para el estudio de alto rendimiento de los cambios fosfoproteómicos globales en las plantas. Para mejorar la sensibilidad y el rendimiento de la fosfoproteómica vegetal, hemos desarrollado un enfoque de extracción de parada e ir (etapa) basado en puntas fosfoproteómicas junto con etiquetado de etiqueta de masa tándem (TMT) para el análisis rápido e integral de la perturbación de la fosforilación vegetal en respuesta al estrés osmótico. Aprovechando la simplicidad y el alto rendimiento de la técnica de punta de etapa, todo el procedimiento tarda aproximadamente una hora utilizando dos consejos para terminar el enriquecimiento de fosfopéptidos, fraccionamiento y pasos de limpieza de muestras, lo que sugiere un fácil de usar y una alta eficiencia del enfoque. Este enfoque no sólo proporciona un análisis de fosfoproteómica vegetal en profundidad (> 11.000 identificación de fosfopéptido) sino que también demuestra la eficiencia de separación superior (< 5% de superposición) entre fracciones adyacentes. Además, se ha logrado la multiplexación utilizando el etiquetado TMT para cuantificar los cambios fosfoproteómicos de las plantas mutantes de decuple de tipo salvaje y snrk2. Este enfoque se ha utilizado con éxito para revelar los eventos de fosforilación de quinasas similares a Raf en respuesta al estrés osmótico, que arroja luz sobre la comprensión de la señalización osmótica temprana en las plantas terrestres.
Introduction
La alta salinidad, las bajas temperaturas y la sequía causan tensiones osmóticas, que es un factor ambiental importante que afecta la productividad de las plantas1,2. La fosforilación proteica es una de las modificaciones post-traslacionales más significativas que median la percepción y la transducción de la señal en respuesta de la planta a la tensión osmótica3,4,5. La proteína quinasa 2s (SnRK2s) relacionada con SNF1 está implicada en la señalización de tensión osmótica6. Nueve de cada diez miembros de la familia SnRK2 muestran una activación significativa en respuesta al estrés osmótico7,8. El snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutante que tiene mutaciones en los diez SnRK2 mostró hipersensibilidad al estrés osmótico. En el mutante snrk2-dec, la acumulación osmótica inducida por estrés de inositol 1,4,5-trisphosphato (IP3),biosíntesis de ácido abscísico (ABA) y expresiones génicas se reducen fuertemente, destacando el papel vital de SnRK2s en las respuestas de estrés osmótico6. Sin embargo, todavía no está claro cómo las quinasas SnRK2s regulan estos procesos biológicos. Perfilar los cambios fosfoproteómicos en respuesta al estrés osmótico es una manera eficiente de cerrar esta brecha y delinear los mecanismos de defensa activados por estrés osmótico en las plantas.
La espectrometría de masas (EM) es una potente técnica para mapear la fosfoproteomavegetal 9. Sin embargo, la caracterización de la fosfoproteómica vegetal sigue siendo un desafío debido al rango dinámico del proteoma vegetal y a la complejidad del lysatovegetal 4. Para superar estos desafíos, desarrollamos un flujo de trabajo fosfoproteómico vegetal universal, que elimina interferencias no deseadas como los pigmentos fotosintéticos y metabolitos secundarios, y permite la cobertura profunda de fosfoproteoma vegetal10. Se han desarrollado varios métodos de enriquecimiento de fosfopéptidos como cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) y cromatografía de óxido metálico (MOC) para enriquecer fosfopéptidos antes del análisis de EM11,12,13,14,15,16. Los no fosfopéptidos ácidos que se purifican con fosfopéptidos son las principales interferencias para la detección de fosfopéptidos. Anteriormente, estandarizamos el valor de pH y la concentración de ácido orgánico del búfer de carga IMAC para eliminar la unión de no fosfopéptidos, para obtener más del 90% de especificidad de enriquecimiento pasando por alto el paso de pre-fraccionamiento11.
La pérdida de muestras en el proceso de varios pasos de enriquecimiento y fraccionamiento de fosfopéptidos dificulta la sensibilidad de la identificación de fosfopéptidos y la profundidad de la cobertura fosfoproteómica. Las puntas stop-and-go-extraction (puntas de escenario) son puntas de pipeta que contienen pequeños discos para tapar el extremo de la punta, que se pueden incorporar con cromatografía para el fraccionamiento de péptidos y limpieza17. La pérdida de muestras durante el procedimiento de la punta del escenario se puede minimizar evitando la transferencia de muestras entre los tubos. Hemos implementado con éxito la punta de etapa en Ga3+-IMAC y Fe3+-IMAC para separar péptidos fosforilados múltiples de baja abundancia de péptidos fosforilados, que mejoraron la profundidad del fosfoproteoma humano15. Además, el uso de alta punta de etapa de fase invertida de pH (Hp-RP) ha demostrado la mayor cobertura del proteoma de membrana humana en comparación con la del intercambio de cationes fuertes (SCX) y la cromatografía de intercambio de aniones fuertes (SAX)18. Por lo tanto, la integración de las técnicas de punta de etapa IMAC y Hp-RP puede aumentar la cobertura de fosfoproteoma vegetal con simplicidad, alta especificidad y alto rendimiento. Hemos demostrado que esta estrategia identificó más de 20.000 sitios de fosforilación de plánexas arabidopsis, lo que representa una mayor profundidad de fosfoproteoma vegetal19.
Aquí, informamos de un protocolo fosfoproteómico basado en la punta de etapa para la elaboración de perfiles fosfoproteómicos en Arabidopsis. Este flujo de trabajo se aplicó para estudiar la perturbación fosfoproteómica de plántulos mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec en respuesta al estrés osmótico. El análisis fosfoproteómico reveló los sitios de fosforilación implicados en la activación de la quinasa y la señalización de estrés osmótico temprano. El análisis comparativo de datos de fosfoprotemas mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec llevó al descubrimiento de una cascada de quinasa similar a Raf (RAF)-SnRK2 que desempeña un papel clave en la señalización de estrés osmore en plantas altas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El rango dinámico y la complejidad del proteoma vegetal y el fosfoproteoma siguen siendo un factor limitante a la profundidad de los análisis de fosfoproteómica. A pesar de la capacidad del análisis LC-MS/EM de una sola ejecución para identificar 10.000 sitios de fosforilación21,22,la cobertura de todo el fosfoproteoma vegetal sigue siendo limitada. Por lo tanto, se requiere un flujo de trabajo fosfoproteómico que proporcione alta sensibilidad y eficiencia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación estratégica prioritaria de la Academia China de Ciencias, Grant XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Referências
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