Presenteras här är en fosfoproteomic strategi, nämligen stoppa och gå extraktionsspetsbaserad fosfoproteomic, som ger hög genomströmning och djup täckning av Arabidopsis fosfoproteome. Detta tillvägagångssätt avgränsar översikten över osmotic stress signalering i Arabidopsis.
Proteinfosforylering är avgörande för reglering av enzymaktivitet och genuttryck under osmotiskt tillstånd. Masspektrometri (MS)-baserade fosfoproteomik har förändrat sättet att studera växtsignaltransduktion. Kravet på massor av utgångsmaterial och förlängd MS-mättid för att uppnå täckningsdjupet har dock varit den begränsande faktorn för den höga genomströmningsstudien av globala fosfoproteomiska förändringar i växter. För att förbättra känsligheten och genomströmningen av växtfosfoproteomik har vi utvecklat en stop and go-extraktion (steg) spetsbaserad fosfoproteomikmetod i kombination med Tandem Mass Tag (TMT) märkning för snabb och omfattande analys av växtfosforyleringsstörning som svar på osmotisk stress. Genom att utnyttja enkelheten och den höga genomströmningen av stegspetsteknik tar hela proceduren ungefär en timme att använda två tips för att avsluta fosfopeptidberikning, fraktionering och provrengöringssteg, vilket tyder på en lättanvänd och hög effektivitet av tillvägagångssättet. Detta tillvägagångssätt ger inte bara en djupgående växtfosfoproteomikanalys (> 11 000 fosfopeptididentifiering) utan visar också den överlägsna separationseffektiviteten (< 5% överlappning) mellan angränsande fraktioner. Vidare har multiplexering uppnåtts med hjälp av TMT-märkning för att kvantifiera fosfoproteomiska förändringar av vilda och snrk2 decuple mutanta växter. Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att avslöja fosforyleringshändelserna hos Raf-liknande kinaser som svar på osmotisk stress, vilket belyser förståelsen av tidig osmotisk signalering i landväxter.
Hög salthalt, låg temperatur och torka orsakar osmotiska påfrestningar, vilket är en viktig miljöfaktor som påverkar anläggningens produktivitet1,2. Proteinfosforylering är en av de viktigaste postöversättningsmodifieringarna som förmedlar signaluppfattning och transduktion i växtrespons på osmotisk stress3,4,5. SNF1-relaterade proteinkinas 2s (SnRK2s) är involverade i osmotisk stresssignalering6. Nio av tio medlemmar av SnRK2-familjen visar betydande aktivering som svar på osmotisk stress7,8. Snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)mutant med mutationer i alla tio SnRK2 visade överkänslighet mot osmotic stress. I snrk2-dec mutant minskar den osmotiska stressinducerade ackumuleringen av inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscissyra (ABA) biosyntes och genuttryck kraftigt, vilket belyser SnRK2s vitala roll i osmotiskastresssvar 6. Det är dock fortfarande oklart hur SnRK2s kinaser reglerar dessa biologiska processer. Profilering av fosfoproteomiska förändringar som svar på osmotisk stress är ett effektivt sätt att överbrygga denna klyfta och avgränsa de osmotiska stressutlösta försvarsmekanismerna i växter.
Masspektrometri (MS) är en kraftfull teknik för kartläggning av växtfosfoproteome9. Karakterisering av växtfosfoproteomik är dock fortfarande en utmaning på grund av det dynamiska intervallet av växtproteom och komplexiteten hos växtlyat4. För att övervinna dessa utmaningar utvecklade vi ett universellt växtfosfoproteomiskt arbetsflöde, vilket eliminerar oönskade störningar som från fotosyntetiska pigment och sekundära metaboliter och möjliggör djup täckning av växtfosfoproteome10. Flera fosfopeptid anrikningsmetoder såsom immobiliserad metalljon affinitet kromatografi (IMAC) och metalloxid kromatografi (MOC) har utvecklats för berika fosfopeptider före MS analys11,12,13,14,15,16. Sura icke-fosfopeptider som samrenar med fosfopeptider är de största interferenserna för fosfopeptiddetektering. Tidigare standardiserade vi pH-värdet och organisk syrakoncentration av IMAC-belastningsbuffert för att eliminera bindningen av icke-fosfopeptider, för att erhålla mer än 90% anrikningsspecifikitet som kringgår förfraktionssteget11.
Provförlust i flerstegsprocessen av fosfopeptidberikning och fraktionering hämmar känsligheten hos fosfopeptididentifiering och djupet av fosfoproteomisk täckning. Stop-and-go-extraktionsspetsar (scentips) är pipettspetsar som innehåller små skivor för att kapa spetsens ände, som kan införlivas med kromatografi för peptidfraktionering ochrengöring 17. Provförlusten under stegspetsproceduren kan minimeras genom att undvika provöverföring mellan rören. Vi har framgångsrikt implementerat stegspets i Ga3 +– IMAC och Fe3 +-IMAC för att separera låga rikliga flera fosforylerade peptider från singly fosforylerade peptider, vilket förbättrade djupet av mänskliga fosfoproteome15. Dessutom har användningen av hög pH omvänd fas (Hp-RP) stegspets visat den bredare täckningen av mänskliga membran proteome jämfört med den för stark katjon utbyte (SCX) och stark anjon utbyte (SAX) kromatografi18. Att integrera IMAC- och Hp-RP-stegspetstekniker kan därför öka anläggningens fosfoproteome-täckning med enkelhet, hög specificitet och hög genomströmning. Vi har visat att denna strategi identifierade mer än 20 000 fosforyleringsplatser från Arabidopsis plantor, vilket representerar ett förbättrat djup av växtfosfoproteome19.
Här rapporterar vi ett stegspetsbaserat fosfoproteomiskt protokoll för fosfoproteomisk profilering i Arabidopsis. Detta arbetsflöde tillämpades för att studera fosfoproteomic stör av vilda och snrk2-dec mutant plantor som svar på osmotic stress. Fosfoproteomic analys visade fosforylering platser inblandade i kinas aktivering och tidiga osmotic stress signalering. Jämförande analys av vilda och snrk2-dec mutanta fosfoproteome data ledde upptäckten av en Raf-liknande kinas (RAF)-SnRK2 kinas kaskad som spelar en nyckelroll i osmore stress signalering i höga växter.
Det dynamiska området och komplexiteten hos växtproteom och fosfoproteome är fortfarande en begränsande faktor till djupet av fosfoproteomiska analyser. Trots förmågan hos LC-MS/MS-analys med enkel körning att identifiera 10 000 fosforyleringsplatser21,22, är täckningen av hela växtfosfoproteom fortfarande begränsad. Därför krävs ett fosfoproteomiskt arbetsflöde som ger hög känslighet och överlägsen separationseffektivitet för att profilera de…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det strategiska prioriterade forskningsprogrammet för Den kinesiska vetenskapsakademin, Grant XDB27040106.
1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |