Strategia fosfoproteomica per la profilazione del segnale di stress osmotico in Arabidopsis
Summary
Qui è presentato un approccio fosfoproteomico, vale a dire fosfoproteomico a base di punta di estrazione stop and go, che fornisce un’elevata produttività e una copertura profonda del fosfoproteoma arabidopsis. Questo approccio delinea la panoramica della segnalazione dello stress osmotico in Arabidopsis.
Abstract
La fosforilazione proteica è fondamentale per la regolazione dell’attività enzimatica e dell’espressione genica in condizioni osmotiche. La spettrometria di massa (MS) basata sulla fosfoproteomica ha trasformato il modo di studiare la trasduzione del segnale vegetale. Tuttavia, il requisito di molte materie prime e il tempo prolungato di misurazione della SM per raggiungere la profondità di copertura è stato il fattore limitante per lo studio ad alta produttività dei cambiamenti fosfoproteomici globali negli impianti. Per migliorare la sensibilità e la produttività della fosfoproteomica vegetale, abbiamo sviluppato un approccio fosfoproteomica a base di punta stop and go (stage) abbinato all’etichettatura Tandem Mass Tag (TMT) per l’analisi rapida e completa della perturbazione della fosforilazione delle piante in risposta allo stress osmotico. Sfruttando la semplicità e l’elevata produttività della tecnica della punta dello stadio, l’intera procedura richiede circa un’ora utilizzando due punte per completare l’arricchimento del fosfopeptide, il frazionamento e le fasi di pulizia del campione, suggerendo un approccio facile da usare e ad alta efficienza. Questo approccio non solo fornisce un’analisi approfondita della fosfoproteomica vegetale (> 11.000 identificazione del fosfopeptide), ma dimostra anche l’efficienza di separazione superiore (< sovrapposizione del 5%) tra frazioni adiacenti. Inoltre, il multiplexing è stato ottenuto utilizzando l'etichettatura TMT per quantificare i cambiamenti fosfoproteomici delle piante mutanti di decuple di tipo selvaggio e snrk2. Questo approccio è stato utilizzato con successo per rivelare gli eventi di fosforilazione delle chinasi simili alla Raf in risposta allo stress osmotico, che fa luce sulla comprensione della segnalazione osmotica precoce nelle piante terrestri.
Introduction
L’alta salinità, la bassa temperatura e la siccità causano stress osmotici, che è un importante fattore ambientale che influisce sulla produttivitàdelle piante 1,2. La fosforilazione proteica è una delle modifiche post-traslazionali più significative che mediano la percezione del segnale e la trasduzione nella risposta delle piante allo stressosmotico 3,4,5. La protein chinasi 2s (SnRK2s) correlata alla SNF1 è coinvolta nella segnalazione dello stress osmotico6. Nove dei dieci membri della famiglia SnRK2 mostrano un’attivazione significativa in risposta allo stressosmotico 7,8. Il mutante snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 (snrk2-dec) con mutazioni in tutte e dieci le SnRK2 mostrava ipersensibilità allo stress osmotico. Nel mutante snrk2-dec, l’accumulo osmotico indotto dallo stress di inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3),biosintesi dell’acido ascisico (ABA) ed espressioni geniche è fortemente ridotto, evidenziando il ruolo vitale di SnRK2s nelle risposte allo stress osmotico6. Tuttavia, non è ancora chiaro come le chinasi SnRK2s regolino questi processi biologici. Profilare i cambiamenti fosfoproteomici in risposta allo stress osmotico è un modo efficiente per colmare questo divario e delineare i meccanismi di difesa osmotici innescati dallo stress nelle piante.
La spettrometria di massa (MS) è una tecnica potente per mappare il fosfoproteoma vegetale9. La caratterizzazione della fosfoproteomica vegetale, tuttavia, rimane una sfida a causa della gamma dinamica del proteoma vegetale e della complessità del lico vegetale4. Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro fosfoproteomico vegetale universale, che elimina le interferenze indesiderate come da pigmenti fotosintetici e metaboliti secondari e consentendo la copertura profonda del fosfoproteoma vegetale10. Diversi metodi di arricchimento del fosfopeptide come la cromatografia immobilizzata dell’affinità ionica metallica (IMAC) e la cromatografia dell’ossido metallico (MOC) sono stati sviluppati per arricchire i fosfopeptidi prima dell’analisi MS11,12,13,14,15,16. I non fosfopeptidi acidi co-purificanti con fosfopeptidi sono le principali interferenze per il rilevamento del fosfopeptide. In precedenza, abbiamo standardizzato il valore del pH e la concentrazione di acido organico del tampone di carico IMAC per eliminare il legame dei non fosfopeptidi, per ottenere più del 90% di specificità di arricchimento bypassando la fase di pre-frazionamento11.
La perdita del campione nel processo in più fasi di arricchimento e frazionamento del fosfopeptide ostacola la sensibilità dell’identificazione del fosfopeptide e la profondità della copertura fosfoproteomica. Le punte di estrazione stop-and-go (punte dello stadio) sono punte di pipetta che contengono piccoli dischi per limitare l’estremità della punta, che possono essere incorporati con cromatografia per il frazionamento peptidico e lapulizia 17. La perdita del campione durante la procedura di punta dello stadio può essere ridotta al minimo evitando il trasferimento del campione tra i tubi. Abbiamo implementato con successo la punta dello stadio in Ga3+-IMAC e Fe3+-IMAC per separare i peptidi fosforilati multipli a bassa abbondanza dai peptidi singolarmente fosforilati, che hanno migliorato la profondità del fosfoproteoma umano15. Inoltre, l’uso di una punta in fase invertita ad alto pH (Hp-RP) ha dimostrato una copertura più ampia del proteoma della membrana umana rispetto a quella di forte scambio di cationi (SCX) e cromatografia a forte scambio di anione (SAX)18. Pertanto, l’integrazione delle tecniche di punta dello stadio IMAC e Hp-RP può aumentare la copertura del fosfoproteoma dell’impianto con semplicità, alta specificità e alta produttività. Abbiamo dimostrato che questa strategia ha identificato più di 20.000 siti di fosforilazione dalle piantine arabidopsis, rappresentando una maggiore profondità del fosfoproteoma vegetale19.
Qui, segnalamo un protocollo fosfoproteomico basato su punta di fase per la profilazione fosfoproteomica in Arabidopsis. Questo flusso di lavoro è stato applicato per studiare la perturbazione fosfoproteomica delle piantine mutanti di tipo selvaggio e snrk2-dec in risposta allo stress osmotico. L’analisi fosfoproteomica ha rivelato i siti di fosforilazione implicati nell’attivazione della chinasi e nella segnalazione precoce dello stress osmotico. L’analisi comparativa dei dati del fosfoproteoma mutante di tipo selvaggio e snrk2-dec ha portato alla scoperta di una cascata di chinasi raf-like (RAF)-SnRK2 chinasi che gioca un ruolo chiave nella segnalazione dello stress di Osmore nelle piante alte.
Protocol
Representative Results
Discussion
La gamma dinamica e la complessità del proteoma e del fosfoproteoma delle piante sono ancora un fattore limitante alla profondità delle analisi fosfoproteomiche. Nonostante la capacità dell’analisi LC-MS/MS a esecuzione singola di identificare 10.000 siti di fosforilazione21,22, la copertura dell’intero fosfoproteoma vegetale è ancora limitata. Pertanto, è necessario un flusso di lavoro fosfoproteomico che fornisca un’elevata sensibilità e un’efficienza di …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca strategica prioritaria dell’Accademia cinese delle scienze, Grant XDB27040106.
Materials
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
Referências
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
