Här beskriver vi starka anjon utbyte högpresterande flytande kromatografi av [3H]-myo-inositol-märkt plantor som är en mycket känslig metod för att upptäcka och kvantifiera inositol polyfosfater i växter.
Fosfat estrar av myo-inositol, också benämns inositol fosfater (InsPs), är en klass av cellulära regulatorer spelar viktiga roller i växtfysiologi. På grund av deras negativa laddning, låga överflöd och mottaglighet för hydrolytiska aktiviteter, är detektion och kvantifiering av dessa molekyler utmanande. Detta gäller särskilt starkt fosforylerade former som innehåller “högenergibindningar” diphospho obligationer, även benämns inositol pyrofosfater (PP-InsPs). På grund av dess höga känslighet, är stark anjon utbyte högpresterande vätskekromatografi (SAX-HPLC) av växter märkta med [3H]-myo-inositol är för närvarande den metod för val att analysera dessa molekyler. Genom att använda [3H]-myo-inositol till radiolabel växt plantor, olika InsP arter inklusive flera icke-enantiomeriska isomerer kan upptäckas och diskrimineras med hög känslighet. Här beskrivs uppställningen av ett lämpligt SAX-HPLC-system, liksom det kompletta arbetsflödet från växtodling, radiolabeling och InsP-extraktion till SAX-HPLC-körningen och efterföljande dataanalys. Det protokoll som presenteras här möjliggör diskriminering och kvantifiering av olika InsP-arter, inklusive flera icke-enantiomeriska isomerer och av PP-InsPs, InsP7 och InsP8, och kan lätt anpassas till andra växtarter. Som exempel utförs SAX-HPLC analyser av Arabidopsis thaliana och Lotus japonicus plantor och komplett InsP profiler presenteras och diskuteras. Den metod som beskrivs här utgör ett lovande verktyg för att bättre förstå InsPs biologiska roller i växter.
Nästan fyra decennier sedan, inositol fosfater (InsPs) fram som signalering molekyler, efter Ins(1,4,5)P3 (InsP3) identifierades som en andra budbärare som aktiverar receptor-medierad frisättning av Ca2 + i djurceller1,2. Hittills har ingen InsP3-receptor (IP3-R) identifierats i växter, som ifrågasätter en direkt signalering roll för InsP3 i växtceller3. Oavsett, InsP3 fungerar som en föregångare för andra InsPs som deltar i flera växtutvecklingsprocesser, inklusive reglering av specifika signalering vägar3,4,5,6,7,8. Till exempel kan InsP3 ytterligare fosforyleras till InsP6, även känd som “fytinsyra”, som representerar en viktig källa till fosfat, myo-inositoloch katjoner, och visades spela nyckelroller i växtförsvar mot patogener, mRNA export och fosfat homeostas5,9,10,11,12.
Inositol pyrofosfater (PP-InsPs) är en klass av InsPs som innehåller minst en högenergi di-fosfosbindning, ursprungligen identifierade i djurceller, amöba och jäst, där de spelar kritiska roller i olika cellulära processer13,14,15. Trots banbrytande arbete på PP-InsPs i växter16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, de biologiska funktioner och isomer identitet dessa molekyler fortfarande i stort sett gåtfulla. I modellen anläggningen Arabidopsis thaliana, cellulära InsP8 föreslogs att reglera försvar mot insektssmakar och nekrotrofa svampar via sammanträffande-detektion av InsP8 och aktiv jasmonate av ASK1-COI1-JAZ receptor komplexa17. Vidare har roller insP8 och andra PP-InsPs i energi homeostas och näringsämnen avkänning, samt fosfat homeostas föreslagits17,23,24,25,26.
Oavsett vilket biologiskt system som används har en stor metodologisk utmaning vid studier av InsPs varit tillförlitlig detektion och exakt kvantifiering av dessa molekyler. Masspektrometribaserade metoder har använts för att upptäcka InsPs, inklusive PP-InsPs, från cellextrakt. Emellertid, dessa studier misslyckades med att skilja distinkta isomerer26,27. En annan metod för att analysera InsPs sysselsätter pull-down av InsPs från cell lysates med TiO2 pärlor, följt av polyakrylamide gel elektrofores (SIDA) av eluted InsPs. Insp:erna kan sedan färgas av antingen toluidinblått eller DAPI24,28,29. Det är dock än så länge inte möjligt att på ett tillförlitligt sätt upptäcka InsPs lägre än InsP5 från växtextrakt med denna metod. Nyligen publicerades en metod med hjälp av [13C]-myo-inositol för kärnmagnetisk resonans (NMR) analys av InsPs som ett alternativ till stark anjon utbyte högpresterande vätskekromatografi (SAX-HPLC)30. Denna teknik har rapporterats för att uppnå en liknande känslighet jämfört med SAX-HPLC och att tillåta detektion av 5-InsP7, samt diskriminering av olika icke-enantiomeriska InsP5 isomerer från cellextrakt. Genomförandet av den NMR-baserade metoden kräver dock kemiskt syntetiserade och kommersiellt inte tillgängliga [13C]-myo-inositol. Därför är den metod som används i de flesta fall radiolabeling prover med [3H]-myo-inositol, följt av SAX-HPLC31,32,33. Denna teknik är baserad på upptag av radioaktiva myo-inositol i anläggningen och dess omvandling till olika InsPs av den kombinerade aktiviteten av dedikerade cellulära kinaser och fosfataser.
Den [3H]-märkta InsPs är sedan syra-extraherade och fraktionerad med hjälp av SAX-HPLC. På grund av deras negativa laddning interagerar InsPsna starkt med det positivt laddade stationärt arrangerar gradvis av SAX-HPLC kolonnen och kan eluteds med en buffertgradient som innehåller ökande fosfatkoncentrationer för att konkurrera ut InsPs från kolonnen. Elutionstider beror således på laddning och geometri av Den InsP-art som ska avskiljas. I avsaknad av kirala kolumner kan endast icke-enantiomeriska isomerer genom åtskilda av detta protokoll. Men radiolabeled standarder kan användas för att tilldela isomeric karaktär av en specifik InsP topp. Flera insatser i det förflutna av olika laboratorier för att generera märkta och omärkta standarder med (bio)kemiska metoder eller att rena dem från olika celler och organismer har hjälpt tilldela toppar till vissa InsP arter, och även att begränsa den isomeriska identiteten hos enskilda InsP-arter5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Också, den senaste klarläggandet av enzymatiska vägar som leder till bildandet av PP-InsPs i växter, samt upptäckten av en bakteriell typ III-effektor med en specifik 1-phytase aktivitet, ge information om hur man genererar användbara standarder för dessa analyser10,17,18,22,23.
De resulterande fraktionerna kan mätas i en vätskescintillationsräknare på grund av β-sönderfall av tritium (3H). Med ökande märkningstid nås en isotopic jämvikt, varefter de erhållna InsP-profilerna ska representera InsP-statusen för anläggningen31. Den stora fördelen med detta protokoll i jämförelse med andra tillgängliga tekniker är den höga känslighet som uppnås genom användning av den direkta föregångaren för InsPs och mätning av en radioaktiv signal.
SAX-HPLC av prover som extraherats från [3H]-myo-inositol-märkta växter eller andra organismer används vanligen för detektion och kvantifiering av InsPs som sträcker sig från lägre InsP-arter till PP-InsPs, vilket representerar ett värdefullt verktyg för att bättre förstå Metabolism, funktion och verkningssätt hos InsPs. Hittills är denna metod också det lämpligaste valet för forskare med särskilt intresse för lägre InsP-arter. Medan grunderna i detta förfarande, på vilket det protokoll som beskrivs här bygger på, har tidigare beskrivits7,21,31,34, ett detaljerat protokoll som är anpassat till analysen av växt-härledda InsPs och särskilt av PP-InsPs saknas fortfarande. Tidigare publikationer rapporterade svårigheter att på ett tillförlitligt sätt upptäcka de låga rikliga PP-InsPs, särskilt InsP8, på grund av en eller flera av följande faktorer: relativt låga mängder växtmaterial, [3H]-myo-inositol med låg specifik aktivitet (> 20 Ci/mmol), användning av extraktionsbuffertar som antingen inte är baserade på perklorsyra eller är mindre koncentrerade än 1 M, olika neutraliserande buffertar, samt suboptimala gradienter eller detektion av [3H] med en on-line detektor. I jämförelse med dessa studier, det protokoll som presenteras här är utformad för tillförlitlig upptäckt av PP-InsPs7,21,34.
Här presenterar vi ett detaljerat arbetsflöde, med början från inställningen av utrustningen till växtodling och märkning, InsP extraktion och SAX-HPLC köra själv. Även om metoden var optimerad till modellen anläggningen A. thaliana, det kan enkelt modifieras för att studera andra växtarter, som visas här med den första rapporterade InsP-profilen av modellen baljväxter Lotus japonicus. Även om användningen av en annan växtart kan kräva viss optimering, vi räknar med att de kommer att vara mindre, vilket gör detta protokoll en bra utgångspunkt för ytterligare forskning i anläggningen InsPs. För att underlätta eventuella optimeringar anger vi varje steg inom protokollet där modifieringar är möjliga, samt alla kritiska steg som kan vara utmanande vid upprättande av metoden för första gången. Dessutom rapporterar vi hur data som erhålls med den här metoden kan användas för kvantifiering av specifika Insp: er och hur olika prover kan analyseras och jämföras.
Här presenterar vi en mångsidig och känslig metod för att kvantifiera InsPs inklusive PP-InsPs i växtextrakt och ger praktiska tips om hur man får denna metod etablerad. Även om protokollet i allmänhet är robust kan suboptimala körningar och analyser uppstå. I de flesta fall kan dessa körningar identifieras genom en kraftig minskning eller till och med fullständig förlust av starkt fosforylerade InsPs, särskilt PP-InsP-arten InsP7 och InsP8. Möjliga orsaker kan vara mikrobiella föroreningar av växtmaterialet och otillräcklig deaktivering av endogen växt PP-InsP-hydrolaser vid extraktion på grund av otillräcklig slipning och upptining av växtmaterial som inte kommer att vara i omedelbar kontakt med extraktionsbuffert. Ytterligare skäl inkluderar felaktig pH-justering genom otillräcklig eller överskottstillskott av neutraliseringsbuffert, eller helt enkelt otillräckligt provmaterial. Det senare kan göra det svårt att upptäcka PP-InsPs, eftersom de ofta finns i mycket låga mängder i cellerna. Ett överskott av provmaterial eller ineffektiv torkning under steg 3.5 kan orsaka utspädning av perklorsyran, vilket därför också leder till otillräcklig enzymavaktivering och en specifik förlust av InsP6 och PP-InsPs. Mängden växtmaterial, samt radiolabel som används i detta protokoll optimerades baserat på kostnader och prestanda, och är därför nära det lägsta belopp som fortfarande är tillräckligt för att ge optimala resultat. Dessutom kommer kolonnharts gradvis lös sin upplösningskapacitet. Det första tecknet på denna process är (av skäl som inte helt klart för författarna) en specifik förlust av högre fosforylerade InsP arter som PP-InsPs i HPLC spektrumet. Med ytterligare åldrande, kommer inte ens InsP6 lösas ordentligt av kolumnen (Bild 1D). Därför är användningen av en adekvat kolumn, samt noggrann hantering av provet och korrekt underhåll av HPLC-komponenterna avgörande för att säkerställa korrekta resultat.
När man jämför prover och körningar, särskilt när de genereras med olika utrustning (t.ex., HPLC-system och kolumner) eller på olika dagar, är det avgörande att normalisera proverna till varandra (som beskrivs i steg 7.3) och att analysera dem på samma sätt. Endast genom normalisering är det möjligt och exakt att visa flera prover i samma graf (Bild 3). För kvantifiering av enskilda InsP:er i förhållande till totala InsP-skivor, eller till en annan specifik InsP-art, är det inte nödvändigt att normalisera, så länge som endast relativa värden och inte absolutvärden visas. Helst visas både InsP-profilerna och kvantifieringarna. I vissa fall är det dock inte möjligt att på ett tillfredsställande sätt visa två eller flera körningar i samma graf. Olika kvarhållningstider eller olika nivåer av bakgrundsaktivitet kan göra det svårt att jämföra okvantifierade SAX-HPLC-profiler ensam. Detsamma är det sanna när många prover måste jämföras. I sådana fall är en ytterligare utvärdering med hjälp av ytterligare en programvara (t.ex. Origin) för individuell toppkvantifiering nödvändig.
Författarna är medvetna om att det protokoll som beskrivs här kan optimeras och behöver anpassas till varje enskild forskningsfråga. Även om optimeras för Arabidopsis extrakt 7,17 i detta protokoll, denna metod är mångsidig och kan hjälpa till att bestämma InsP profiler av andra växtarter också. Här exemplifierar vi denna möjlighet genom att för första gången presentera en InsP-profil för L. japonicus, som inte krävde några modifieringar av märkningsförhållandena, InsP-utsug eller SAX-HPLC-körning (Figur 2). Noterbart, medan övergripande liknande, skillnader observeras mellan L. japonicus och Arabidopsis InsP profiler. Till exempel i L. japonicus InsP5 [4-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [6-OH] är rikligare än InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH] i jämförelse med Arabidopsis, där InsP5 [1-OH] eller dess enantiomeriska form InsP5 [3-OH] är den dominerande InsP5 arter. På samma sätt räknar vi med att förändringar i mediesammansättningen, [3H]- myo-inositol-koncentration, växtålder, miljöförhållanden (t.ex. ljus och temperatur), tillsats av kemiska föreningar eller analyser av växt-mikrobiella interaktioner bland andra faktorer, kan behöva testas och anpassas.myo
En viktig nackdel med denna metod som måste beaktas är att märkningen sker i en (steril) flytande kultur, som inte representerar en fysiologisk miljö för de flesta landväxter. Dessutom, på grund av de höga kostnaderna för [³H]-myo-inositol, volymen av märkningslösningen och storleken på odlingskärlet är i allmänhet begränsad, vilket också begränsar storleken på de växter som kan användas. Odling i flytande kultur kan undvikas genom att direkt infiltrera för exempel blad av jord-odlade växter med [³H]-myo-inositol och därefter efter det protokoll som beskrivs här, som tidigarerapporterats 10.
Det finns flera nackdelar med detta protokoll i jämförelse med alternativa metoder, såsom TiO2 pull-down följt av SIDA eller masspektrometri baserade tekniker. På grund av den [3H]-myo-inositol-märkning, kommer endast InsP-arter som direkt härstammar från radiolabeled myo-inositol att upptäckas till. Den metod som beskrivs här är blind för andra Ins isomerer såsom scyllo-inositol och andra isomerer varav några har identifierats i vissa växter44. Vidare kommer myo-InsPs som härrör från andra vägar att uteslutas, inklusive de som syntetiseras av de novo syntes av myo-inositol och myo-inositol-3-fosfat via isomerisering av glukos-6-fosfat, katalyseras av myo-inositol-3-fosfatsyntas (MIPS) proteiner45. Även om [32P] eller [33P]-orto-fosfat kan användas som alternativa etiketter, utgör deras användning en stor nackdel, eftersom varje fosfathaltig molekyl, inklusive de rikliga nukleotider och dess derivat, kommer att märkas. Dessa molekyler kan också extraheras med detta protokoll och binda till SAX kolumnen, vilket kommer att resultera i en hög nivå av bakgrundsaktivitet som kommer att störa identifieringen av enskilda InsP toppar5. Dessutom kan kvantifiering av [32P]- eller [33P] -märkta InsPs och PP-InsPs påverkas starkt av fosfat och pyrofosfat moiety omsättning och kanske inte rapportera en massa avläsning för inositol arter.
Å andra sidan, [3H]-myo-inositol specifikt etiketter myo-inositol-innehållande molekyler. InsPs, inositol-innehållande lipider, såsom fosfositider, och galactinol är i detta fall märkt. Endast InsPs kommer dock att analyseras med detta protokoll, eftersom lipider är olösliga i extraktionsbufferten och galactinol inte binder till SAX-kolumnen.
Hittills är skillnaderna från en anläggning InsP profil som genereras av [3H]-myo-inositol märkning jämfört med en bestäms av TiO2 pulldown / PAGE fortfarande okänd, eftersom sådana jämförelser inte har utförts i växter. En nyligen genomförd studie i djurceller tog upp denna fråga46. I det arbetet identifierades en pool av InsP6 som är osynlig genom [3H]-myo-inositol-märkning, som därigenom direkt bör härledas från glukos-6-fosfat, genom att jämföra SAX-HPLC-profiler med PAGE geler av däggdjurscelllinjer. 24 h av fosfat svält resulterade i en 150% ökning av InsP6 när kvantifiera SIDA geler av InsPs renas med hjälp av TiO2 pulldown. SAX-HPLC-analyser av [3H]-myo-inositol-märkta celler som behandlades identiskt bara visade en ökning med 15% av [3H]-InsP6. Som tidigare nämnts, InsPs lägre än InsP5 är omöjlig att upptäcka med PAGE analys i de flesta fall. Radiolabeling följt av SAX-HPLC verkar vara den metod för val, så länge masspektrometriska protokoll inte är optimerade för att upptäcka denna grupp av mycket negativt laddade molekyler.
En annan kvarvarande utmaning är att skilja enantiomerer i SAX-HPLC-analyser (eller i någon annan metod för InsP-analys)10,17. Denna utmaning kan hanteras genom tillägg av kirala väljare, dvs, enantiopure föreningar som L-arginin amid som interagerar med respektive enantiomeriska molekyler för att bilda diastereomeric komplex som kan separeras10. Vår kännedom om detta tillvägagångssätt har bara genomförts för att diskriminera den enantiomeriska InsP5 isomerer InsP5 [1-OH] och InsP5 [3-OH] av NMR analyser10. Diskriminering av andra enantiomeriska par eller framgångsrik diskriminering av enantiomerer genom kiral SAX-HPLC-analys eller kirala PAGE-baserade metoder har ännu inte rapporterats och bör utvecklas ytterligare. Med tanke på den bevarade syntesen och den bevarade regleringen av PP-InsPs genom fosfor tillgänglighet, föreställer vi oss att särskilt icke-radioaktiva metoder som PAGE eller MS-baserade metoder, tillsammans med näringsanalyser, kommer att hjälpa marken truthing ansträngningar för att kalibrera fjärranalys data som syftar till att diagnostisera näringsbrist i grödor17,18,24,25. Men den metod som presenteras här kan för närvarande fortfarande anses vara guldmyntfoten för InsP analyser och kommer att vara avgörande för att upptäcka nya funktioner av dessa spännande budbärare i växter.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för Tysklands excellence strategy – EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), forskningsutbildningsgruppen GRK2064 och individuella forskningsanslag SCHA1274/4-1 och SCHA1274/5-1 till G.S.. Vi tackar också Li Schlüter och Brigitte Ueberbach för tekniskt bistånd.
Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
pH-indicator paper pH 5.5 – 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |