Systemanalyse af det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske respons på traumatisk hjerneskade
Summary
Denne protokol præsenterer metoder til at karakterisere det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske respons på mild traumatisk hjerneskade og til at integrere disse data som en del af en multivariat systemanalyse ved hjælp af delvis mindste kvadratisk regression.
Abstract
Milde traumatiske hjerneskader (mTBIs) er et væsentligt folkesundhedsproblem. Gentagen eksponering for mTBI kan føre til kumulative, langvarige funktionelle underskud. Talrige undersøgelser fra vores gruppe og andre har vist, at mTBI stimulerer cytokinekspression og aktiverer microglia, nedsætter cerebral blodgennemstrømning og metabolisme og forringer cerebrovaskulær reaktivitet. Desuden har flere værker rapporteret en sammenhæng mellem forstyrrelser i disse neuroinflammatoriske og hæmodynamiske markører og kognitive svækkelser. Heri beskriver vi metoder til at karakterisere det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske vævsrespons på mTBI hos mus. Specifikt beskriver vi, hvordan man udfører en vægtfaldsmodel af mTBI, hvordan man i længderetningen måler cerebral blodgennemstrømning ved hjælp af en ikke-invasiv optisk teknik kaldet diffus korrelationsspektroskopi, og hvordan man udfører et Luminex multiplexet immunassay på hjernevævsprøver for at kvantificere cytokiner og immunmodulerende phospho-proteiner (f.eks. Inden for MAPK- og NFκB-vejene), der reagerer på og regulerer aktiviteten af mikroglia og andre neurale immunceller. Endelig beskriver vi, hvordan man integrerer disse data ved hjælp af en multivariat systemanalysemetode for at forstå forholdet mellem alle disse variabler. At forstå forholdet mellem disse fysiologiske og molekylære variabler vil i sidste ende gøre det muligt for os at identificere mekanismer, der er ansvarlige for mTBI.
Introduction
Overblik
Milde traumatiske hjerneskader (mTBI’er) påvirker ~ 1,6-3,8 millioner atleter årligt1. Disse skader, herunder sub-hjernerystelse og hjernerystelse, kan efterlade patienter med forbigående fysiske, følelsesmæssige, psykologiske og kognitive symptomer2. Desuden kan gentagen mTBI (rmTBI), der opretholdes inden for et “sårbarhedsvindue”, føre til kumulativ sværhedsgrad og varighed af kognitive konsekvenser, der varer længere end virkningerne af en enkelt mTBI alene3, og i sidste ende endda til permanent tab af funktion 4,5,6. Selvom mange patienter kommer sig inden for en relativt kort tidsramme ( 1 måned, hvor nogle varer op til 1 år 3,7,8,9. På trods af den høje forekomst og varige konsekvenser af disse skader er skadesmekanismer dårligt forstået, og der findes ingen effektive behandlingsstrategier.
I betragtning af den store variation i resultaterne efter mTBI/rmTBI er en udfordring ved at identificere molekylære udløsere fra væv opnået i terminale mTBI/rmTBI-undersøgelser manglen på langsgående data, der viser endelige “akutte molekylære forbindelser” af disse molekylære udløsere til langsigtede resultater. For at overvinde denne udfordring har vores gruppe opdaget, at akut reduceret cerebral blodgennemstrømning målt akut ved hjælp af et optisk værktøj kaldet diffus korrelationsspektroskopi (DCS) stærkt korrelerer med langsigtet kognitivt resultat i en musemodel af rmTBI10. Ved hjælp af denne hæmodynamiske biomarkør viste vi, at mus med akut lav cerebral blodgennemstrømning (og i forlængelse heraf dårligere forudsagt langsigtet resultat) har samtidige akutte stigninger i neuronal phospho-signalering inden for både MAPK- og NFκB-veje, stigninger i neuronal ekspression af proinflammatoriske cytokiner og stigninger i ekspression af fagocyt/mikroglialmarkøren Iba111 . Disse data tyder på en mulig rolle for neuronal phospho-signalering, cytokinekspression og mikroglial aktivering i både den akutte regulering af cerebral blodgennemstrømning efter skade såvel som i at udløse en signalkaskade, der fører til neuronal dysfunktion og værre kognitivt resultat. Heri beskriver vi vores tilgang til samtidig at undersøge både det hæmodynamiske og neuroinflammatoriske miljø efter rmTBI, og hvordan man integrerer disse komplekse datasæt. Specifikt skitserer vi procedurer for fire vigtige trin til denne omfattende tilgang: (1) en vægtfaldsmodel for mild traumatisk hjerneskade, (2) vurdering af cerebral blodgennemstrømning med diffus korrelationsspektroskopi, (3) kvantificering af det neuroinflammatoriske miljø og (4) dataintegration (figur 1). Nedenfor giver vi en kort introduktion til hvert af disse vigtige trin for at hjælpe med at guide læserne gennem rationalet bag vores metoder. Resten af manuskriptet indeholder en detaljeret protokol for hvert af disse nøgletrin.
Vægtfaldsmodel af mild traumatisk hjerneskade
Selvom der findes mange fremragende prækliniske modeller af gentagen mild TBI 12,13,14,15,16,17,18, anvender vi en veletableret og klinisk relevant vægtfaldsmodel med lukket hovedskade. Nøglefunktioner i denne model omfatter (1) stump påvirkning af det intakte kranium / hovedbund efterfulgt af ubegrænset rotation af hovedet om halsen, (2) ingen åbenlys strukturel hjerneskade, ødem, blod-hjernebarriereskade, akut celledød eller kronisk hjernevævstab og (3) vedvarende (op til 1 år) kognitive underskud, der først opstår efter flere hits19 (figur 2).
Vurdering af cerebral blodgennemstrømning med diffus korrelationsspektroskopi
Diffus korrelationsspektroskopi (DCS) er en ikke-invasiv optisk teknik, der målerblodgennemstrømningen 5,20,21. I DCS placeres en nær-infrarød lyskilde på vævsoverfladen. En detektor placeres i en fast afstand fra kilden på vævsoverfladen for at detektere lys, der har formeret sig spredt gennem vævet (figur 3). Spredning af bevægelige røde blodlegemer får den detekterede lysintensitet til at svinge med tiden. En simpel analytisk model kendt som korrelationsdiffusionsteori bruges til at relatere disse intensitetsudsving til et indeks for blodgennemstrømning (CBFi, figur 4). Selvom enhederneCBF i (cm2/s) ikke er de traditionelle strømningsenheder (ml/min/100 g), har en tidligere undersøgelse på mus vist, at CBFi stærkt korrelerer med cerebral blodgennemstrømning målt ved arteriel spin mærket MR21.
Til reference blev DCS-instrumentet, der anvendes her, bygget internt og består af en 852 nm lang kohærenslængdelaser, en række 4 fotontællende lavinefotodioder og et hardware-autokorrelatorkort (enkelt tau, 8 kanal, 100 ns minimum prøvetid)21,22. Data erhverves med hjemmelavet software skrevet i LabView. Dyregrænsefladen til enheden består af en 400 μm multimode kildefiber (400-2200 nm bølgelængdeområde, ren silicakerne, TECS Hard Cladding) og en 780 nm single mode detektorfiber (780-970 nm bølgelængdeområde, ren silicakerne, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm anden tilstand afskæring) med en afstand på 6 mm fra hinanden og indlejret i en sort 3D-trykt sensor (4 mm x 8 mm, Figur 3).
Kvantificering af det neuroinflammatoriske miljø
Selvom neuroinflammation reguleres af forskellige cellulære processer, er to vigtige relevante mekanismer ekstracellulær signalering af cytokiner / kemokiner og intracellulær signalering af phosphoproteiner. For at undersøge det neuroinflammatoriske miljø i hjernen efter skaden ekstraheres hjerner fra mus, mikrodissekteret, og cytokiner / kemokiner og phosphoproteiner kvantificeres ved hjælp af Luminex (figur 5, figur 6, figur 7). Luminex multiplexerede immunassays muliggør samtidig kvantificering af en forskelligartet samling af disse proteiner ved at koble enzymbundne immunosorbentassays (ELISA’er) til fluorescerende mærkede magnetiske perler. Forskellige fluorescerende tags anvendes til hvert protein af interesse, og perler af hvert mærke funktionaliseres med et fangstantistof mod det pågældende protein. Hundredvis af perler til indfangning af hvert protein blandes sammen, placeres i en 96 brøndplade og inkuberes med prøve. Efter prøveinkubation bruges en magnet til at fange perlerne i brønden, mens prøven vaskes ud. Dernæst binder biotinyleret detektionsantistof sig til den analyt, der er af interesse, for at danne en antistof-antigensandwich svarende til en traditionel ELISA, men med ELISA for hvert protein, der forekommer på en anden fluorescerende mærket perle. Tilsætning af phycoerythrin-konjugeret streptavidin (SAPE) fuldender hver reaktion. Luminex-instrumentet læser derefter perlerne og adskiller signalet i henhold til hvert fluorescerende mærke / protein.
Integration af data
På grund af det store antal analytter (f.eks. cytokiner), der måles i Luminex-analysen, kan dataanalyse være vanskelig at fortolke, hvis hvert kvantificeret protein analyseres individuelt. For at forenkle analysen og fange tendenser observeret blandt analytter bruger vi en multivariat analysemetode kaldet delvis mindste kvadratisk regression (PLSR, figur 8)23. PLSR virker ved at identificere en vægtakse svarende til hvert målt protein (dvs. cytokiner eller phospho-proteiner, kaldet “prædiktorvariabler”), der tilsammen optimalt forklarer co-varians af de målte proteiner med en responsvariabel (f.eks. Cerebral blodgennemstrømning). Vægtene kaldes “belastninger” og samles i en vektor kendt som en latent variabel (LV). Ved at projicere (kaldet “scoring”) de målte proteindata på hver af to GV’er, kan dataene omplottes med hensyn til disse IV’er. Efter beregning af PLSR bruger vi en varimax-rotation til at identificere en ny LV, der maksimerer kovariansen mellem prøvefremskrivningerne på LV og prædiktorvariablen24. Denne tilgang giver os mulighed for at definere LV1 som den akse, for hvilken variansen af responsvariablen bedst forklares. LV2 maksimerer samevariansen mellem responsvariablen og LV1-restdata, som kan være forbundet med biologisk eller teknisk variabilitet mellem prøver. Endelig gennemfører vi en Leave One Out Cross Validation (LOOCV) for at sikre, at PLSR-modellen ikke er stærkt afhængig af en enkelt prøve23.
I denne protokol beskriver vi metoder til at karakterisere det neuroinflammatoriske og hæmodynamiske vævsrespons på mTBI. Den generelle arbejdsgang er skitseret i figur 1. I denne protokol er mus underlagt en eller flere mTBI’er ved hjælp af en vægt-drop lukket hovedskademodel. Cerebral blodgennemstrømning måles i længderetningen før og på flere tidspunkter efter skade. På tidspunktet for interesse for forhør af neuroinflammatoriske ændringer aflives dyret, og hjernen ekstraheres. Hjerneområder af interesse isoleres via mikrodissektion og lyses derefter for at ekstrahere protein. Lysater anvendes derefter til både Luminex multiplexerede immunassays af cytokin og phospho-protein ekspression samt Western blot. Endelig integreres dette holistiske datasæt ved hjælp af en delvis regressionsanalyse af mindst kvadrater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri beskriver vi metoder til vurdering af den hæmodynamiske og neuroinflammatoriske reaktion på gentagen mild traumatisk hjerneskade. Desuden har vi vist, hvordan man integrerer disse data som en del af en multivariat systemanalyse ved hjælp af delvis mindste kvadratisk regression. I teksten nedenfor vil vi diskutere nogle af de vigtigste trin og begrænsninger forbundet med protokollen samt fordele / ulemper ved metoderne i forhold til eksisterende metoder.
Vægt-drop model af mil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev støttet af National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) og R01 NS115994 (LBW / EB) og Children’s Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Dette arbejde blev også støttet af det amerikanske forsvarsministerium gennem congressionally Directed Medical Research Programs under Award No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Udtalelser, fortolkninger, konklusioner og anbefalinger er forfatterens og er ikke nødvendigvis godkendt af forsvarsministeriet. Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. 1937971. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
Referências
- Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
- Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
- Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. . Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury – an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport–the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
- Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
- Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
- Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
- Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
- Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment–part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
- Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury–part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
- Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
- Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
- Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
- Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
- Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
- Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
- Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
- Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
- . plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019)
- White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
- Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
- Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
- Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
- Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).
