Analyse systémique de la réponse neuroinflammatoire et hémodynamique aux lésions cérébrales traumatiques
Summary
Ce protocole présente des méthodes pour caractériser la réponse neuro-inflammatoire et hémodynamique à une lésion cérébrale traumatique légère et pour intégrer ces données dans le cadre d’une analyse des systèmes multivariés utilisant la régression partielle des moindres carrés.
Abstract
Les lésions cérébrales traumatiques légères (TBI) constituent un problème de santé publique important. Une exposition répétée au TCC peut entraîner des déficits fonctionnels cumulatifs et durables. De nombreuses études menées par notre groupe et d’autres ont montré que le TCC stimule l’expression des cytokines et active la microglie, diminue le flux sanguin cérébral et le métabolisme et altère la réactivité cérébrovasculaire. De plus, plusieurs travaux ont rapporté une association entre les dérangements dans ces marqueurs neuro-inflammatoires et hémodynamiques et les troubles cognitifs. Nous détaillons ici les méthodes permettant de caractériser la réponse des tissus neuro-inflammatoires et hémodynamiques au TCC chez la souris. Plus précisément, nous décrivons comment effectuer un modèle de perte de poids de l’ITCm, comment mesurer longitudinalement le flux sanguin cérébral à l’aide d’une technique optique non invasive appelée spectroscopie de corrélation diffuse, et comment effectuer un immunodosage multiplexé Luminex sur des échantillons de tissu cérébral pour quantifier les cytokines et les phospho-protéines immunomodulatrices (par exemple, dans les voies MAPK et NFκB) qui répondent et régulent l’activité de la microglie et d’autres cellules immunitaires neurales. Enfin, nous détaillons comment intégrer ces données à l’aide d’une approche d’analyse de systèmes multivariés pour comprendre les relations entre toutes ces variables. Comprendre les relations entre ces variables physiologiques et moléculaires nous permettra en fin de compte d’identifier les mécanismes responsables de l’ITM.
Introduction
Aperçu
Les lésions cérébrales traumatiques légères (TBI) touchent environ 1,6 à 3,8 millions d’athlètes chaque année1. Ces blessures, y compris les commotions cérébrales et commotionnelles, peuvent laisser les patients avec des symptômes physiques, émotionnels, psychologiques et cognitifs transitoires2. De plus, les ITM répétitifs (ITMR) maintenus dans une « fenêtre de vulnérabilité » peuvent entraîner une gravité et une durée cumulatives des conséquences cognitives qui durent plus longtemps que les effets d’un seul TCC seul3, et finalement même à une perte permanente de la fonction 4,5,6. Bien que de nombreux patients se rétablissent dans un délai relativement court ( 1 mois, certains pouvant durer jusqu’à 1 an 3,7,8,9. Malgré la prévalence élevée et les conséquences durables de ces blessures, les mécanismes des blessures sont mal compris et aucune stratégie de traitement efficace n’existe.
Compte tenu de la grande variabilité des résultats après un TCC/ITRM, l’un des défis à relever pour identifier les déclencheurs moléculaires à un stade précoce des tissus obtenus dans les études sur les ITCm/ITRM en phase terminale est le manque de données longitudinales démontrant des « liens moléculaires aigus » définitifs de ces déclencheurs moléculaires avec des résultats à plus long terme. Pour surmonter ce défi, notre groupe a découvert que le débit sanguin cérébral extrêmement réduit mesuré de manière aiguë à l’aide d’un outil optique appelé spectroscopie de corrélation diffuse (DCS) est fortement corrélé avec les résultats cognitifs à long terme dans un modèle murin de rmTBI10. En utilisant ce biomarqueur hémodynamique, nous avons montré que les souris ayant un flux sanguin cérébral extrêmement bas (et, par extension, un résultat à long terme prédit pire) ont des augmentations aiguës concomitantes de la signalisation phospho neuronale dans les voies MAPK et NFκB, une augmentation de l’expression neuronale des cytokines pro-inflammatoires et une augmentation de l’expression du marqueur phagocytaire / microglial Iba111 . Ces données suggèrent un rôle possible pour la signalisation neuronale des phosphos, l’expression des cytokines et l’activation microgliale à la fois dans la régulation aiguë du flux sanguin cérébral après une blessure ainsi que dans le déclenchement d’une cascade de signalisation qui conduit à un dysfonctionnement neuronal et à des résultats cognitifs pires. Ici, nous détaillons notre approche pour sonder simultanément l’environnement hémodynamique et neuroinflammatoire après rmTBI et comment intégrer ces ensembles de données complexes. Plus précisément, nous décrivons les procédures pour quatre étapes clés de cette approche globale : (1) un modèle de perte de poids de lésion cérébrale traumatique légère, (2) l’évaluation du flux sanguin cérébral avec spectroscopie de corrélation diffuse, (3) la quantification de l’environnement neuroinflammatoire et (4) l’intégration des données (Figure 1). Ci-dessous, nous fournissons une brève introduction à chacune de ces étapes clés pour aider à guider les lecteurs à travers la raison d’être de nos méthodes. Le reste du manuscrit fournit un protocole détaillé pour chacune de ces étapes clés.
Modèle de perte de poids d’une lésion cérébrale traumatique légère
Bien qu’il existe de nombreux excellents modèles précliniques de TCC légerrépétitifs 12,13,14,15,16,17,18, nous utilisons un modèle de lésion de la tête fermée bien établi et cliniquement pertinent. Les principales caractéristiques de ce modèle comprennent (1) l’impact contondant du crâne et du cuir chevelu intact suivi d’une rotation sans restriction de la tête autour du cou, (2) aucune lésion cérébrale structurelle manifeste, œdème, lésion de la barrière hémato-encéphalique, mort cellulaire aiguë ou perte chronique de tissu cérébral, et (3) déficits cognitifs persistants (jusqu’à 1 an) qui n’apparaissent qu’après plusieurs coups19 (Figure 2).
Évaluation du flux sanguin cérébral par spectroscopie de corrélation diffuse
La spectroscopie de corrélation diffuse (DCS) est une technique optique non invasive qui mesure le flux sanguin 5,20,21. Dans DCS, une source de lumière proche infrarouge est placée à la surface du tissu. Un détecteur est placé à une distance fixe de la source à la surface du tissu pour détecter la lumière qui s’est multipliée diffusée à travers le tissu (Figure 3). La diffusion des globules rouges en mouvement fait fluctuer l’intensité lumineuse détectée avec le temps. Un modèle analytique simple connu sous le nom de théorie de la diffusion de corrélation est utilisé pour relier ces fluctuations d’intensité à un indice de flux sanguin (CBFi, Figure 4). Bien que les unités de CBFi (cm2/s) ne soient pas les unités traditionnelles de débit (mL/min/100 g), une étude antérieure chez la souris a montré que la CBFi est fortement corrélée au flux sanguin cérébral mesuré par IRM21 marquée par spin artériel.
À titre de référence, l’instrument DCS utilisé ici a été construit en interne et est composé d’un laser de 852 nm de longueur de cohérence, d’un réseau de photodiodes d’avalanche de comptage de 4 photons et d’une carte d’autocorrélation matérielle (tau unique, 8 canaux, temps d’échantillonnage minimum de 100 ns)21,22. Les données sont acquises avec un logiciel maison écrit en LabView. L’interface animale de l’appareil se compose d’une fibre source multimode de 400 μm (gamme de longueurs d’onde de 400 à 2200 nm, noyau de silice pure, revêtement dur TECS) et d’une fibre de détection monomode de 780 nm (gamme de longueurs d’onde de 780 à 970 nm, noyau de silice pure, revêtement dur TECS, coupure de 730 ± de 30 nm en deuxième mode) espacée de 6 mm et intégrée dans un capteur noir imprimé en 3D (4 mm x 8 mm, Graphique 3).
Quantification de l’environnement neuro-inflammatoire
Bien que la neuroinflammation soit régulée par divers processus cellulaires, deux mécanismes clés pertinents sont la signalisation extracellulaire par les cytokines/chimiokines et la signalisation intracellulaire par les phospho-protéines. Pour étudier l’environnement neuro-inflammatoire du cerveau après une lésion, les cerveaux sont extraits de souris, microdisséqués, et les cytokines/chimiokines et les phospho-protéines sont quantifiées à l’aide de Luminex (Figure 5, Figure 6, Figure 7). Les immunoessais multiplexés Luminex permettent la quantification simultanée d’une collection diversifiée de ces protéines en couplant des tests immuno-enzymatiques (ELISA) à des billes magnétiques marquées par fluorescence. Des étiquettes fluorescentes distinctes sont utilisées pour chaque protéine d’intérêt, et les perles de chaque étiquette sont fonctionnalisées avec un anticorps de capture contre cette protéine particulière. Des centaines de perles pour capturer chaque protéine sont mélangées ensemble, placées dans une plaque de 96 puits et incubées avec un échantillon. Après l’incubation de l’échantillon, un aimant est utilisé pour piéger les perles dans le puits pendant que l’échantillon est lavé. Ensuite, l’anticorps de détection biotinylé se lie à l’analyte d’intérêt pour former un sandwich anticorps-antigène similaire à un ELISA traditionnel, mais avec l’ELISA pour chaque protéine se produisant sur une perle différente marquée par fluorescence. L’ajout de streptavidine conjuguée à la phycoérythrine (SAPE) complète chaque réaction. L’instrument Luminex lit ensuite les perles et sépare le signal en fonction de chaque étiquette fluorescente / protéine.
Intégration des données
En raison du grand nombre d’analytes (p. ex. cytokines) mesurés dans le test Luminex, l’analyse des données peut être difficile à interpréter si chaque protéine quantifiée est analysée individuellement. Pour simplifier l’analyse et saisir les tendances observées chez les analytes, nous utilisons une méthode d’analyse multivariée appelée régression partielle des moindres carrés (PLSR, Figure 8)23. Le PLSR fonctionne en identifiant un axe de poids correspondant à chaque protéine mesurée (c.-à-d. cytokines ou phospho-protéines, appelées « variables prédictives ») qui, ensemble, expliquent de manière optimale la co variance des protéines mesurées avec une variable de réponse (p. ex., le flux sanguin cérébral). Les poids sont appelés « charges » et sont assemblés en un vecteur connu sous le nom de variable latente (LV). En projetant (ce qu’on appelle le « scoring ») les données sur les protéines mesurées sur chacune des deux LV, les données peuvent être retracées en termes de ces LV. Après avoir calculé le PLSR, nous utilisons une rotation varimax pour identifier un nouveau LV qui maximise la covariance entre les projections de l’échantillon sur le LV et la variable prédictive24. Cette approche nous permet de définir LV1 comme l’axe pour lequel la variance de la variable de réponse est la mieux expliquée. La VL2 maximise la copartisance entre la variable de réponse et les données résiduelles de la VL1, qui peuvent être associées à une variabilité biologique ou technique entre les échantillons. Enfin, nous effectuons une validation croisée LOOCV (Leave One Out Cross Validation) pour nous assurer que le modèle PLSR ne dépend pas fortement d’un échantillon23.
Dans ce protocole, nous détaillons les méthodes pour caractériser la réponse des tissus neuro-inflammatoires et hémodynamiques au TCC. Le flux de travail général est décrit à la figure 1. Dans ce protocole, les souris sont soumises à un ou plusieurs TLIS en utilisant un modèle de traumatisme crânien fermé en chute libre. Le débit sanguin cérébral est mesuré longitudinalement avant et à plusieurs moments après la blessure. Au moment de l’interrogation des changements neuro-inflammatoires, l’animal est euthanasié et le cerveau est extrait. Les régions cérébrales d’intérêt sont isolées par microdissection, puis lysées pour extraire des protéines. Les lysats sont ensuite utilisés à la fois pour les immunoessais multiplexés Luminex de l’expression des cytokines et des phospho-protéines ainsi que pour le Transfert Western. Enfin, cet ensemble de données holistique est intégré à l’aide d’une analyse de régression partielle des moindres carrés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous détaillons ici les méthodes d’évaluation de la réponse hémodynamique et neuroinflammatoire à une lésion cérébrale traumatique légère répétitive. De plus, nous avons montré comment intégrer ces données dans le cadre d’une analyse de systèmes multivariés utilisant la régression partielle des moindres carrés. Dans le texte ci-dessous, nous discuterons de certaines des étapes clés et des limites associées au protocole ainsi que des avantages / inconvénients des méthodes par rapport aux méth…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été soutenu par les National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) et R01 NS115994 (LBW/EB) et Children’s Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Ce travail a également été soutenu par le département de la Défense des États-Unis par le biais des programmes de recherche médicale dirigés par le Congrès sous le numéro de bourse. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par le Programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention n ° 1937971. Toutes les opinions, constatations et conclusions ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation.
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
Referências
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