Systemanalyse av nevroinflammatorisk og hemodynamisk respons på traumatisk hjerneskade
Summary
Denne protokollen presenterer metoder for å karakterisere nevroinflammatorisk og hemodynamisk respons på mild traumatisk hjerneskade og å integrere disse dataene som en del av en multivariat systemanalyse ved hjelp av delvis minste kvadraters regresjon.
Abstract
Milde traumatiske hjerneskader (mTBIer) er et betydelig folkehelseproblem. Gjentatt eksponering for mTBI kan føre til kumulative, langvarige funksjonelle underskudd. Tallrike studier av vår gruppe og andre har vist at mTBI stimulerer cytokinuttrykk og aktiverer mikroglia, reduserer cerebral blodstrøm og metabolisme, og svekker cerebrovaskulær reaktivitet. Videre har flere arbeider rapportert en sammenheng mellom derangementer i disse nevroinflammatoriske og hemodynamiske markørene og kognitive svikt. Heri beskriver vi metoder for å karakterisere nevroinflammatorisk og hemodynamisk vevsrespons på mTBI hos mus. Spesielt beskriver vi hvordan du utfører en vektfallsmodell av mTBI, hvordan man langsgående måler cerebral blodstrøm ved hjelp av en ikke-invasiv optisk teknikk kalt diffus korrelasjonsspektroskopi, og hvordan man utfører en Luminex multiplekset immunoassay på hjernevevsprøver for å kvantifisere cytokiner og immunmodulerende fosforproteiner (f.eks. innenfor MAPK- og NFκB-banene) som reagerer på og regulerer aktiviteten til mikroglia og andre nevrale immunceller. Til slutt beskriver vi hvordan du integrerer disse dataene ved hjelp av en multivariat systemanalysetilnærming for å forstå sammenhengene mellom alle disse variablene. Å forstå sammenhengene mellom disse fysiologiske og molekylære variablene vil til slutt gjøre oss i stand til å identifisere mekanismer som er ansvarlige for mTBI.
Introduction
Oversikt
Milde traumatiske hjerneskader (mTBIer) påvirker ~ 1,6-3,8 millioner idrettsutøvere årlig1. Disse skadene, inkludert sub-concussive og hjernerystelser, kan etterlate pasienter med forbigående fysiske, emosjonelle, psykologiske og kognitive symptomer2. Videre kan repeterende mTBI (rmTBI) opprettholdt i et “sårbarhetsvindu” føre til kumulativ alvorlighetsgrad og varighet av kognitive konsekvenser som varer lenger enn effektene av en enkelt mTBI alene3, og til slutt til og med til permanent tap av funksjon 4,5,6. Selv om mange pasienter gjenoppretter innenfor en relativt kort tidsramme ( 1 måned, med noen som varer opptil 1 år 3,7,8,9. Til tross for den høye utbredelsen og varige konsekvensene av disse skadene, er skademekanismer dårlig forstått og det finnes ingen effektive behandlingsstrategier.
Gitt den høye variasjonen i resultatene etter mTBI/rmTBI, er en utfordring med å identifisere tidlige molekylære utløsere fra vev oppnådd i terminale mTBI/rmTBI-studier mangelen på langsgående data som demonstrerer definitive “akutte molekylære koblinger” av disse molekylære utløserne til langsiktige resultater. For å overvinne denne utfordringen har gruppen vår oppdaget at akutt redusert cerebral blodstrøm målt akutt ved hjelp av et optisk verktøy kalt diffus korrelasjonsspektroskopi (DCS), korrelerer sterkt med langsiktig kognitivt utfall i en musemodell av rmTBI10. Ved hjelp av denne hemodynamiske biomarkøren viste vi at mus med akutt lav cerebral blodstrøm (og i forlengelsen av verre anslått langtidsutfall) har samtidige akutte økninger i nevronal fosforsignalering innenfor både MAPK- og NFκB-veier, økning i nevronuttrykk av proinflammatoriske cytokiner, og økning i uttrykk for fagocytt/mikroglialmarkør Iba111 . Disse dataene antyder en mulig rolle for nevronal fosforsignalering, cytokinuttrykk og mikroglial aktivering i både akutt regulering av hjerneblodstrømsskade samt i å utløse en signalkaskade som fører til nevronal dysfunksjon og verre kognitivt utfall. Heretter beskriver vi vår tilnærming til samtidig sonde både det hemodynamiske og nevroinflammatoriske miljøet etter rmTBI og hvordan vi integrerer disse komplekse datasettene. Nærmere bestemt skisserer vi prosedyrer for fire viktige trinn i denne omfattende tilnærmingen: (1) en vektdråpemodell av mild traumatisk hjerneskade, (2) vurdering av cerebral blodstrøm med diffus korrelasjonsspektroskopi, (3) kvantifisering av nevroinflammatorisk miljø og (4) dataintegrasjon (figur 1). Nedenfor gir vi en kort introduksjon til hvert av disse viktige trinnene for å hjelpe leserne gjennom begrunnelsen bak metodene våre. Resten av manuskriptet gir en detaljert protokoll for hvert av disse viktige trinnene.
Vektfallsmodell av mild traumatisk hjerneskade
Selv om mange gode prekliniske modeller av repeterende mild TBI eksisterer 12,13,14,15,16,17,18, bruker vi en veletablert og klinisk relevant vektfall lukket hodeskade modell. Viktige trekk ved denne modellen inkluderer (1) stump innvirkning av den intakte skallen / hodebunnen etterfulgt av ubegrenset rotasjon av hodet om nakken, (2) ingen overt strukturell hjerneskade, ødem, blod-hjerne barriere skade, akutt celledød, eller kronisk hjernevev tap, og (3) vedvarende (opptil 1 år) kognitive underskudd som bare dukker opp etter flere treff19 (Figur 2).
Vurdering av cerebral blodstrøm med diffus korrelasjonsspektroskopi
Diffus korrelasjonsspektroskopi (DCS) er en ikke-invasiv optisk teknikk som måler blodstrømmen 5,20,21. I DCS plasseres en nær-infrarød lyskilde på vevsoverflaten. En detektor er plassert i en fast avstand fra kilden på vevsoverflaten for å oppdage lys som har formert seg spredt gjennom vevet (figur 3). Spredning av bevegelige røde blodlegemer fører til at den oppdagede lysintensiteten svinger med tiden. En enkel analytisk modell kjent som korrelasjonsdiffusjonsteori brukes til å relatere disse intensitetssvingningene til en indeks for blodstrøm (CBFi, figur 4). Selv om enhetene til CBFi (cm2/s) ikke er de tradisjonelle strømningsenhetene (ml/min/100 g), har en tidligere studie hos mus vist at CBFi sterkt korrelerer med cerebral blodstrøm målt ved arteriell spinn merket MR21.
For referanse ble DCS-instrumentet som ble brukt her bygget internt og består av en 852 nm lang coherence-lengde laser, en rekke 4 fotontellingsfotodioder og et autokorrelatorkort for maskinvare (enkelt tau, 8 kanaler, 100 ns minimum prøvetid)21,22. Data er anskaffet med hjemmelaget programvare skrevet i LabView. Dyregrensesnittet for enheten består av en 400 μm multimodus kildefiber (400-2200 nm bølgelengdeområde, ren silikakjerne, TECS Hard Cladding) og en 780 nm enkeltmodusdetektorfiber (780-970 nm bølgelengde, ren silikakjerne, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm andre modus cut-off) fordelt 6 mm fra hverandre og innebygd i en svart 3D-trykt sensor (4 mm x 8 mm, Figur 3).
Kvantifisering av nevroinflammatorisk miljø
Selv om nevroinflammasjon er regulert av ulike cellulære prosesser, er to viktige relevante mekanismer ekstracellulær signalering av cytokiner / kjemokiner og intracellulær signalering av fosfoproteiner. For å undersøke hjernens nevroinflammatoriske miljø etter skaden, ekstraheres hjerner fra mus, mikrodisserte og cytokiner/kjemokiner og fosfoproteiner kvantifiseres ved hjelp av Luminex (figur 5, figur 6, figur 7). Luminex multipleksede immunoassays muliggjør samtidig kvantifisering av en mangfoldig samling av disse proteinene ved å koble enzymbundne immunosorbente analyser (ELISAer) til fluorescerende merkede magnetiske perler. Distinkte fluorescerende koder brukes for hvert protein av interesse, og perler av hver tag er funksjonalisert med et fangstantistoff mot det aktuelle proteinet. Hundrevis av perler for å fange hvert protein blandes sammen, plasseres i en 96 brønnplate og inkuberes med prøve. Etter prøveinkubasjon brukes en magnet til å fange perlene i brønnen mens prøven vaskes ut. Deretter binder biotinylert deteksjonsantistoff til analytten av interesse for å danne et antistoff-antigensmørbrød som ligner en tradisjonell ELISA, men med ELISA for hvert protein som forekommer på en annen fluorescerende merket perle. Tilsetning av fycoerythrin-konjugert streptavidin (SAPE) fullfører hver reaksjon. Luminex-instrumentet leser deretter perlene og skiller signalet i henhold til hver fluorescerende tag / protein.
Dataintegrasjon
På grunn av det store antallet analytter (f.eks. cytokiner) målt i Luminex-analysen, kan dataanalyse være vanskelig å tolke hvis hvert kvantifiserte protein analyseres individuelt. For å forenkle analysen og fange opp trender observert blant analytter, bruker vi en multivariat analysemetode kalt delvis minste kvadraters regresjon (PLSR, figur 8)23. PLSR virker ved å identifisere en vektakse som tilsvarer hvert målte protein (dvs. cytokiner eller fosfoproteiner, referert til som “prediktorvariabler”) som sammen forklarer kovariasjon av de målte proteinene optimalt med en responsvariabel (f.eks. cerebral blodstrøm). Vektene kalles “laster” og monteres i en vektor kjent som en latent variabel (LV). Ved å projisere (referert til som “scoring”) de målte proteindataene på hver av to LVer, kan dataene plottes på nytt når det gjelder disse LVene. Etter beregning av PLSR bruker vi en varimax-rotasjon for å identifisere en ny LV som maksimerer kovariansen mellom prøveprojeksjonene på LV og prediktorvariabelen24. Denne tilnærmingen lar oss definere LV1 som aksen som variansen til responsvariabelen best forklares for. LV2 maksimerer samvariasjonen mellom responsvariabelen og LV1 restdata, som kan være forbundet med biologisk eller teknisk variasjon mellom prøver. Til slutt gjennomfører vi en Leave One Out Cross Validation (LOOCV) for å sikre at PLSR-modellen ikke er sterkt avhengig av ett utvalg23.
I denne protokollen beskriver vi metoder for å karakterisere nevroinflammatorisk og hemodynamisk vevsrespons på mTBI. Den generelle arbeidsflyten er beskrevet i figur 1. I denne protokollen er mus underlagt en eller flere mTBIer ved hjelp av en vektfall lukket hodeskademodell. Cerebral blodstrøm måles langsgående før og på flere tidspunkter etter skade. På tidspunktet for interesse for avhør av nevroinflammatoriske endringer, blir dyret euthanized, og hjernen ekstraheres. Hjerneregioner av interesse isoleres via mikrodesisseksjon og lyser deretter for å trekke ut protein. Lysates brukes deretter til både Luminex multipleksed immunoassays av cytokin og fosfo-protein uttrykk samt vestlig blot. Til slutt er dette holistiske datasettet integrert ved hjelp av en delvis minste kvadratisk regresjonsanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi metoder for vurdering av hemodynamisk og nevroinflammatorisk respons på repeterende mild traumatisk hjerneskade. Videre har vi vist hvordan du integrerer disse dataene som en del av en multivariat systemanalyse ved hjelp av delvis minste kvadraters regresjon. I teksten nedenfor vil vi diskutere noen av de viktigste trinnene og begrensningene knyttet til protokollen, samt fordelene / ulempene ved metodene over eksisterende metoder.
Vektfallsmodell av mild traumatisk hj…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble støttet av National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) og R01 NS115994 (LBW/EB) og Children’s Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Dette arbeidet ble også støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet gjennom Congressionally Directed Medical Research Programs under Award No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er forfatterens og er ikke nødvendigvis godkjent av Forsvarsdepartementet. Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. 1937971. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation.
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
Referências
- Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
- Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
- Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. . Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury – an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport–the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
- Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
- Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
- Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
- Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
- Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment–part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
- Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury–part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
- Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
- Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
- Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
- Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
- Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
- Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
- Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
- Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
- . plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019)
- White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
- Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
- Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
- Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
- Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).
