Uma tela supressora para a caracterização de links genéticos regulando a vida cronológica em Saccharomyces cerevisiae

Resumo

Aqui está um protocolo para identificar interações genéticas através de uma tela supressora de número de cópia aumentada em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite que os pesquisadores identifiquem, clonem e testem supressores em mutantes de levedura de curta duração. Testamos o efeito do aumento do número de cópias de SIR2 na vida útil em um mutante nulo autofagia.

Resumo

O envelhecimento é o tempo dependente da deterioração dos processos biológicos normais de um organismo que aumenta a probabilidade de morte. Muitos fatores genéticos contribuem para alterações no processo normal de envelhecimento. Esses fatores se cruzam de forma complexa, como evidenciado pela riqueza de elos documentados identificados e conservados em muitos organismos. A maioria desses estudos se concentra na perda de função, mutantes nulos que permitem a triagem rápida de muitos genes simultaneamente. Há muito menos trabalho que se concentra em caracterizar o papel que a superexpressão de um gene nesse processo. No presente trabalho, apresentamos uma metodologia simples para identificar e clonar genes na levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae, para estudo em supressão do fenótipo cronológico de vida curta visto em muitas origens genéticas. Este protocolo foi projetado para ser acessível a pesquisadores de uma ampla variedade de origens e em vários estágios acadêmicos. O gene SIR2, que codifica uma deacetilase histone, foi selecionado para clonagem no vetor pRS315, pois houve relatos conflitantes sobre seu efeito sobre a vida cronológica. O SIR2 também desempenha um papel na autofagia, que resulta quando interrompida através da exclusão de vários genes, incluindo o fator de transcrição ATG1. Como prova de princípio, clonamos o gene SIR2 para realizar uma tela supressora no fenótipo de vida encurtado característico do mutante atg1Δ deficiente da autofagia e compará-lo com um fundo genético isogênico e selvagem.

Introdução

O envelhecimento é a perda de integridade dependente do tempo em uma miríade de processos biológicos que, em última análise, aumenta a probabilidade de morte organismoal. O envelhecimento é quase inevitável para todas as espécies. Em nível celular, existem várias marcas bem caracterizadas que estão associadas ao envelhecimento, incluindo: instabilidade genômica, alterações epigenéticas, perda de proteostase, disfunção mitocondrial, sensoriamento de nutrientes desregulamentado, senescência celular e atrito de telômero^1,,2. Em organismos unicelulares, como as leveduras, isso leva a uma redução do potencial repli....

Protocolo

1. Identifique interações genéticas potenciais para triagem

1. Identifique o histórico genético para caracterização, que resulta em uma vida cronológica anormalmente curta (CLS) em Saccharomyces cerevisiae usando o Banco de Dados do Genoma de Saccharomyces (o SGD, https://www.yeastgenome.org^29,,30), que compila informações fenotípicas conhecidas para este organismo.
   1. Selecione a guia Função nas opções na parte superior da página web.
   2. Selecione o Fenótipo seguido pela seleção de Procurar todos os Fenótipos.
   3. ....

Resultados

Como há relatos conflitantes sobre o papel do SIR2 durante o envelhecimento, escolhemos este gene para estudo como um potencial supressor do fenótipo CLS do mutante atg1Δ ²⁶. O papel do SIR2 é um tanto controverso, com relatórios conflitantes sobre seu papel na extensão da CLS, porém tem sido claramente ligado ao aumento da CLS em pelo menos um fundo de levedura, com um papel tanto na autofagia quanto na mitofagia^22,,3.......

Discussão

Desvendar a genética do envelhecimento é um desafio difícil, com muitas oportunidades para estudos mais aprofundado que podem potencialmente produzir insights significativos sobre as interações complexas que existem. Existem muitos métodos que permitem a rápida geração de mutantes de perda de função para o estudo de cepas nulas de levedura^45,46. Este método apresenta uma abordagem simples para identificar e clonar genes no vetor pRS315 para estudos supressores de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de DNA fúngico / bacteriano	Zymo Research	D6005
Enzima HindIIIHF	New England Biolabs	R3104S
Phusion DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs	M0530S
Kit de minipreparação de plasmídeo	Qiagen	12123
Enzima SacII	New England Biolabs	R0157S
Salmão DNA de esperma	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S