经济高效且适应性强的划痕迁移检测
Summary
我们为划痕迁移分析提供了一种经济高效的方法，它提供了一种无需使用设备密集型方法即可确定细胞迁移的新方法。虽然本协议使用了成纤维细胞，但它可以被改编并用于研究其他细胞类型和对细胞迁移的影响。
Abstract
细胞迁移是生理和病理事件的关键组成部分。正常细胞迁移是基本功能（如开发和安装免疫反应）所需的。当细胞迁移过程中发生缺陷或改变时，它可能会产生有害的结果（即癌症转移、伤口愈合和疤痕形成）。由于细胞迁移的重要性，有必要获得经济实惠、适应性强且可重复的细胞迁移检测。利用常见的划痕迁移测定，我们开发了一种使用一般实验室设备分析细胞迁移的新方法。所述方法使用视觉标记，无需使用延时显微镜即可重述特定感兴趣的区域。此外，它还在实验设计中提供了灵活性，从改变迁移基质基质到添加药理修饰剂。此外，此协议概述了一种解释单元格迁移区域的方法，在检查单元格迁移时，有几种方法没有考虑该区域。这种新方法为更多的受众提供了划痕迁移分析，并将为研究人员提供更大的机会来研究细胞迁移的生理和病理生理影响。
Introduction
细胞迁移对于许多生理和病理事件都至关重要。这是需要在开发过程中，安装免疫反应，并适当的伤口愈合1，2，3。许多这些细胞迁移事件可能由物理或化学信号触发。例如，在免疫反应期间，白细胞会因化疗2而向损伤发生地迁移。此外，白细胞也将释放细胞因子，诱导其他免疫细胞的迁移，以及其他细胞类型，如成纤维细胞，参与伤口愈合过程，从而启动多细胞反应4。细胞的迁移能力对适当的生理功能至关重要;然而，当细胞迁移不加控制时，它可以有不良反应，并促成病理事件，如慢性炎症，血管疾病，癌症转移，和受损的伤口愈合2，3，4，5，6，7。受损的伤口愈合是糖尿病患者常见的疾病，由于细胞迁移的缺陷，如果这些缺陷不得到解决，它可能导致进一步的并发症（例如，截肢8，9）。这项研究，以及其他人，已经表明需要进一步了解细胞迁移的过程，无论是正常的生理或病理条件下，这对于推进这一领域的研究至关重要。为了做到这一点，需要提供迁移测定，这些研究人员可能不具备进行这些测定所需的设备，而且能够负担得起。
目前，有多种迁移分析可用于检查有关细胞迁移的广泛主题。已开发 2D 和 3D 迁移模型，每个模型都针对影响单元迁移的特定区域。3D迁移模型通常与细胞入侵研究相关，并评估细胞外基质对细胞迁移10、11、12的影响，而2D迁移分析具有更大的应用范围，主要用于研究细胞迁移过程中的化疗迁移、伤口愈合和功能变化。其中一些检测需要额外的设备，如博伊登室或排除环，这可以降低这些测定的可用性，某些研究人员。一个更经济效率的检测是划痕分析，它通常用于评估伤口愈合和细胞迁移的一般变化14，17。虽然大多数实验室都配备进行划痕检测，但用于跟踪细胞迁移的设备往往不可用或过于昂贵，无法购买。这包括延时显微镜，这需要倒置显微镜和实时成像系统。这些昂贵的设备通常不是每个实验室都能接触到的。因此，这一观察突出了需要一个新的协议，允许评估细胞迁移与更容易获得的设备。
此处介绍的协议提供了一种新的且经济实惠的方法来评估单元迁移。此方法遵循与划痕测定相关的相同过程，但在利用基础科学实验室环境中更常见的设备来检查细胞迁移的分析中有所不同。该协议使用通用设备，无需使用延时显微镜即可更准确地确定细胞迁移。除了确定迁移之外，此方法还考虑到划痕区域中的可变因素，这些因素已注意到对单元迁移产生很大影响。总体而言，这一新的细胞迁移分析协议为更多的实验室提供了探索和贡献细胞迁移领域的机会。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种新的划痕迁移测定方法为研究人员提供了一种更容易访问的方法，可以检查细胞迁移的变化。虽然此测定遵循与其他划痕测定类似的划痕相同的过程，但它确实为细胞迁移10的成像和准确分析提供了一种新方法。这种方法没有使用设备密集型的延时显微镜和活细胞成像室方法，而是详细介绍了常用实验室设备的使用情况。利用一般的倒置显微镜和照相机，可以同时捕获迁移?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国陆军医学研究奖#81XWH-16-1-0710，密西西比大学药学院和生物分子科学系的支持。
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
Referências
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
