Un saggio di migrazione dei graffi economico e adattabile
Summary
Presentiamo un metodo conveniente per il test di migrazione dei graffi che fornisce un nuovo approccio per determinare la migrazione cellulare senza l’uso di metodi ad alta intensità di apparecchiature. Mentre i fibroblasti sono stati utilizzati in questo protocollo, possono essere adattati e utilizzati per studiare ulteriori tipi di cellule e influenze sulla migrazione cellulare.
Abstract
La migrazione cellulare è una componente chiave sia negli eventi fisiologici che patologici. La normale migrazione cellulare è necessaria per funzioni essenziali come lo sviluppo e il montaggio di una risposta immunitaria. Quando si verifica un difetto o un’alterazione con il processo di migrazione cellulare, può avere esiti dannosi (ad esempio, metastasi del cancro, guarigione delle ferite e formazione di cicatrici). A causa dell’importanza della migrazione cellulare, è necessario avere accesso a un test di migrazione cellulare conveniente, adattabile e ripetibile. Utilizzando il comune test di migrazione dei graffi, abbiamo sviluppato un nuovo approccio all’analisi della migrazione cellulare che utilizza apparecchiature di laboratorio generali. Il metodo descritto utilizza marcatori visivi che consentono di riconquistare aree specifiche di interesse senza l’uso di microscopia time-lapse. Inoltre, fornisce flessibilità nella progettazione sperimentale, che va dall’alterazione del substrato della matrice di migrazione all’aggiunta di modificatori farmacologici. Inoltre, questo protocollo delinea un modo per tenere conto dell’area di migrazione delle celle, che non viene presa in considerazione da diversi metodi quando si esamina la migrazione delle celle. Questo nuovo approccio offre un saggio di migrazione dei graffi a un pubblico più ampio e offrirà maggiori opportunità ai ricercatori di esaminare l’impatto fisiologico e fisiopatico della migrazione cellulare.
Introduction
La migrazione cellulare è fondamentale per molti eventi fisiologici e patologici. È necessario durante lo sviluppo, per montare una risposta immunitaria e per una corretta guarigione delleferite 1,2,3. Molti di questi eventi di migrazione cellulare possono essere innescati da segnali fisici o chimici. Ad esempio, durante una risposta immunitaria, i leucociti migreranno verso un sito di lesione in risposta a un chemioattrattante2. Inoltre, i leucociti rilasceranno anche citochine per indurre la migrazione di cellule immunitarie aggiuntive, così come altri tipi di cellule, come i fibroblasti, che sono coinvolti nel processo di guarigione delle ferite, e quindi, avviando una risposta multicellulare4. La capacità delle cellule di migrare è essenziale per una corretta funzione fisiologica; tuttavia, quando la migrazione cellulare non viene controllata, può avere una risposta avversa e contribuire a eventi patologici, come infiammazione cronica, malattia vascolare, metastasi tumorale e alterazione della guarigione delleferite 2,3,4,5,6,7. La guarigione delle ferite compromessa è una comune afflizione dei diabetici a causa di difetti nella migrazione cellulare e, se questi difetti non vengono affrontati, potrebbe portare a ulteriori complicazioni (ad esempio, amputazione8,9). Questo studio, così come altri, hanno indicato la necessità di comprendere ulteriormente il processo attraverso il quale avviene la migrazione cellulare, sia in normali condizioni fisiologiche che patologiche, ed è vitale per promuovere questo campo di ricerca. A tal fine, sono disponibili test di migrazione accessibili e accessibili a quei ricercatori, che potrebbero non possedere le attrezzature necessarie per condurre questi test.
Attualmente, sono disponibili una varietà di test di migrazione per esaminare un’ampia gamma di argomenti relativi alla migrazione cellulare. Sono stati sviluppati sia modelli di migrazione 2D che 3D, ognuno dei quali mira ad aree specifiche che hanno un impatto sulla migrazione cellulare. I modelli di migrazione 3D sono tipicamente associati a studi sull’invasione cellulare e valutano l’impatto della matrice extracellulare sulla migrazionecellulare 10,11,12, mentre i test di migrazione 2D hanno una maggiore gamma di applicazioni e vengono utilizzati principalmente per studiare la migrazione chemiotattica, la guarigione delle ferite e i cambiamenti funzionali durante la migrazione cellulare13,14,15,16. Molti di questi saggi richiedono attrezzature aggiuntive, come camere Boyden o anelli di esclusione, che possono ridurre la disponibilità di questi test per alcuni ricercatori. Uno dei saggi più economici è il test scratch, che viene in genere utilizzato per valutare la guarigione delle ferite e i cambiamenti generali nella migrazione cellulare14,17. Mentre la maggior parte dei laboratori sono attrezzati per condurre un test scratch, le apparecchiature utilizzate per tenere traccia della migrazione cellulare tendono ad essere non disponibili o troppo costose da acquistare. Ciò include la microscopia time-lapse, che richiede un microscopio invertito e un sistema di imaging dal vivo. Questi costosi pezzi di equipaggiamento non sono comunemente accessibili a tutti i laboratori. Pertanto, questa osservazione evidenzia la necessità di un nuovo protocollo che consenta la valutazione della migrazione cellulare con apparecchiature più prontamente disponibili.
Il protocollo qui presentato fornisce un modo nuovo e conveniente per valutare la migrazione cellulare. Questo metodo segue la stessa procedura associata ai test scratch ma differisce nell’analisi dell’esame della migrazione cellulare utilizzando apparecchiature più comunemente disponibili in un laboratorio di scienze di base. Questo protocollo che utilizza apparecchiature comuni consente una determinazione più accurata della migrazione cellulare senza l’uso di microscopia time-lapse. Oltre a determinare la migrazione, questo metodo rappresenta anche fattori variabili nell’area scratch che è stato notato per influire notevolmente sulla migrazione delle celle. Nel complesso, questo nuovo protocollo per l’analisi della migrazione cellulare offre a più laboratori l’opportunità di esplorare e contribuire al campo della migrazione cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo nuovo approccio al test di migrazione dei graffi fornisce un metodo più accessibile per i ricercatori per esaminare i cambiamenti nella migrazione cellulare. Sebbene questo saggio segua la stessa procedura per la somministrazione di un graffio simile ad altri test scratch, fornisce un nuovo metodo per l’imaging e l’analisi accurata della migrazionecellulare 10. Invece di utilizzare metodi ad alta intensità di apparecchiature di microscopia time-lapse e camere di imaging a celle vive, ques…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dallo US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, dalla University of Mississippi School of Pharmacy e dal Dipartimento di Scienze BioMolecolari.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
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