Um ensaio de migração de arranhões econômico e adaptável
Summary
Apresentamos um método econômico para o ensaio de migração de arranhões que fornece uma nova abordagem para determinar a migração celular sem o uso de métodos intensivos em equipamentos. Embora os fibroblastos tenham sido usados neste protocolo, ele pode ser adaptado e utilizado para estudar tipos e influências adicionais de células na migração celular.
Abstract
A migração celular é um componente-chave em eventos fisiológicos e patológicos. A migração celular normal é necessária para funções essenciais, como o desenvolvimento e a montagem de uma resposta imune. Quando ocorre um defeito ou alteração com o processo de migração celular, ele pode ter desfechos prejudiciais (ou seja, metástase do câncer, cicatrização de feridas e formação de cicatrizes). Devido à importância da migração celular, é necessário ter acesso a um ensaio de migração celular acessível, adaptável e repetível. Utilizando o ensaio comum de migração de arranhões, desenvolvemos uma nova abordagem para analisar a migração celular que utiliza equipamentos de laboratório gerais. O método descrito utiliza marcadores visuais que permitem a recapturação de áreas específicas de interesse sem o uso de microscopia de lapso de tempo. Além disso, proporciona flexibilidade no design experimental, desde a alteração do substrato da matriz migratória até a adição de modificadores farmacológicos. Além disso, este protocolo descreve uma forma de explicar a área de migração celular, que não é considerada por vários métodos ao examinar a migração celular. Esta nova abordagem oferece um ensaio de migração de arranhões para um público maior e proporcionará maior oportunidade para os pesquisadores examinarem o impacto fisiológico e fisiofisiológico da migração celular.
Introduction
A migração celular é crucial para muitos eventos fisiológicos e patológicos. É necessário durante o desenvolvimento, para a montagem de uma resposta imune, e para a cicatrização adequada da ferida1,2,3. Muitos desses eventos de migração celular podem ser desencadeados por sinais físicos ou químicos. Por exemplo, durante uma resposta imune, os leucócitos migrarão para um local de lesão em resposta a um quimioattractant2. Além disso, os leucócitos também liberarão citocinas para induzir a migração de células imunes adicionais, bem como outros tipos de células, como os fibroblastos, que estão envolvidos no processo de cicatrização da ferida, e assim, iniciando uma resposta multicelular4. A capacidade das células de migrar é essencial para uma função fisiológica adequada; no entanto, quando a migração celular passa descontrolada, pode ter uma resposta adversa e contribuir para eventos patológicos, como inflamação crônica, doença vascular, metástase do câncer e cicatrização de feridasprejudicadas 2,3,4,5,6,7. A cicatrização de feridas prejudicadas é uma aflição comum de diabéticos devido a defeitos na migração celular, e se esses defeitos não forem resolvidos, pode levar a complicações adicionais (por exemplo, amputação8,9). Este estudo, assim como outros, indicou a necessidade de compreender melhor o processo pelo qual ocorre a migração celular, seja em condições fisiológicas normais ou patológicas, e é vital para promover esse campo de pesquisa. Para isso, é preciso que haja ensaios migratórios disponíveis, acessíveis e acessíveis aos pesquisadores, que podem não possuir os equipamentos necessários para a realização desses ensaios.
Atualmente, há uma variedade de ensaios migratórios disponíveis para examinar uma ampla gama de tópicos sobre migração celular. Ambos os modelos de migração 2D e 3D foram desenvolvidos, cada um visando áreas específicas que impactam a migração celular. Modelos de migração 3D são tipicamente associados a estudos de invasão celular e avaliam o impacto da matriz extracelular na migração celular10,11,12, enquanto os ensaios de migração 2D têm uma maior gama de aplicações e são usados principalmente para estudar migração quimotactica, cicatrização de feridas e alterações funcionais durante a migração celular13,14,15,16. Vários desses ensaios exigem equipamentos adicionais, como câmaras de Boyden ou anéis de exclusão, o que pode reduzir a disponibilidade desses ensaios para certos pesquisadores. Um dos ensaios mais econômicos é o ensaio de arranhões, que é normalmente usado para avaliar a cicatrização de feridas e mudanças gerais na migração celular14,17. Embora a maioria dos laboratórios esteja equipada para realizar um ensaio de arranhões, os equipamentos usados para rastrear a migração celular tendem a ser indisponíveis ou muito caros para comprar. Isso inclui microscopia de lapso de tempo, que requer um microscópio invertido e um sistema de imagem ao vivo. Esses equipamentos caros não são comumente acessíveis a todos os laboratórios. Portanto, esta observação destaca a necessidade de um novo protocolo que permita a avaliação da migração celular com equipamentos mais facilmente disponíveis.
O protocolo aqui apresentado fornece uma nova e acessível maneira de avaliar a migração celular. Este método segue o mesmo procedimento associado a ensaios de risco, mas difere na análise da migração celular examinando utilizando equipamentos mais comumente disponíveis em um ambiente de laboratório de ciências básicas. Este protocolo usando equipamento comum permite uma determinação mais precisa da migração celular sem o uso de microscopia de lapso de tempo. Além de determinar a migração, esse método também contabiliza fatores variáveis na área de risco que tem sido notados como um impacto muito grande na migração celular. No geral, este novo protocolo de análise de migração celular oferece uma oportunidade para mais laboratórios explorarem e contribuirem para o campo da migração celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Essa nova abordagem do ensaio de migração de arranhões fornece um método mais acessível para os pesquisadores examinarem as mudanças na migração celular. Embora este ensaio siga o mesmo procedimento para administrar um arranhão semelhante a outros ensaios de risco, ele fornece um novo método para imagem e análise precisa da migração celular10. Em vez de usar métodos intensivos em equipamentos de microscopia de lapso de tempo e câmaras de imagem de células vivas, este método detalh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Médica do Exército dos EUA #81XWH-16-1-0710, pela Faculdade de Farmácia da Universidade do Mississipi e pelo Departamento de Ciências Biomoleculares.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
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