En omkostningseffektiv og fleksibel Scratch Migration Assay
Summary
Vi præsenterer en omkostningseffektiv metode til scratch migration assay, der giver en ny tilgang til bestemmelse af celle migration uden brug af udstyr-intensive metoder. Mens fibroblaster blev brugt i denne protokol, Det kan tilpasses og udnyttes til at studere yderligere celletyper og påvirkninger på celle migration.
Abstract
Cellemigration er en vigtig komponent i både fysiologiske og patologiske hændelser. Normal cellemigration er nødvendig for væsentlige funktioner såsom udvikling og montering af et immunrespons. Når en defekt eller ændring sker med celle migration proces, det kan have skadelige resultater (dvs. kræft metastase, sårheling, og ardannelse). På grund af vigtigheden af cellemigrering er det nødvendigt at have adgang til en cellemigreringsanalyse, der er overkommelig, fleksibel og repeterbar. Ved hjælp af den fælles scratch migration analyse, har vi udviklet en ny tilgang til at analysere celle migration, der bruger generelle laboratorieudstyr. Den beskrevne metode anvender visuelle markører, der gør det muligt at generobre bestemte områder af interesse uden brug af tidsforskænde mikroskopi. Desuden giver det fleksibilitet i forsøgsdesignet, lige fra ændring af migrationsmatrixunderlaget til tilsætning af farmakologiske modifikatorer. Desuden skitserer denne protokol en måde at tage højde for området cellemigrering på, hvilket ikke betragtes ved flere metoder, når cellemigrering undersøges. Denne nye tilgang giver en ridse migration assay til et større publikum og vil give større mulighed for forskere til at undersøge de fysiologiske og patofysiologiske virkninger af celle migration.
Introduction
Cellemigration er afgørende for mange fysiologiske såvel som patologiske hændelser. Det er nødvendigt under udvikling, for montering af en immunrespons, og for korrekt sårheling1,2,3. Mange af disse cellemigrationshændelser kan udløses af fysiske eller kemiske signaler. For eksempel, under en immunrespons, leukocytter vil migrere mod et sted for skade som reaktion på en chemoattractant2. Derudover vil leukocytter også frigive cytokiner for at fremkalde migration af yderligere immunceller samt andre celletyper, såsom fibroblaster, som er involveret i sårhelingsprocessen, og dermed indlede en flercellet respons4. Cellernes evne til at migrere er afgørende for korrekt fysiologisk funktion; men når cellemigration går ukontrolleret, kan det have en negativ respons og bidrage til patologiske hændelser, såsom kronisk inflammation, vaskulær sygdom, kræftmetastase, og nedsat sårheling2,3,4,5,6,7. Nedsat sårheling er en almindelig lidelse af diabetikere på grund af fejl i cellemigration, og hvis disse defekter ikke er rettet, kan det føre til yderligere komplikationer (f.eks amputation8,9). Denne undersøgelse, såvel som andre, har vist behovet for yderligere at forstå den proces, hvorefter celle migration opstår, enten under normale fysiologiske eller patologiske forhold, og det er afgørende for at fremme dette forskningsområde. For at opnå dette, der skal være migration analyser til rådighed, der er både tilgængelige og overkommelige for de forskere, der måske ikke besidder det nødvendige udstyr til at udføre disse analyser.
I øjeblikket er der en række migrationsanalyser til rådighed for at undersøge en bred vifte af emner vedrørende cellemigrering. Der er udviklet både 2D- og 3D-migreringsmodeller, som hver især er rettet mod specifikke områder, der påvirker cellemigrering. 3D-migrationsmodeller er typisk forbundet med celleinvasionsundersøgelser og vurderer virkningen af ekstracellulær matrix på cellemigration10,11,12, mens 2D-migrationsanalyser har en større vifte af anvendelses- og primært anvendes til at studere kemisk migration, sårheling og funktionelle ændringer under cellemigration13,14,15,16. Flere af disse analyser kræver ekstra udstyr, såsom Boyden kamre eller udelukkelse ringe, som kan reducere tilgængeligheden af disse analyser til visse forskere. En af de mere omkostningseffektive analyser er ridseanalysen, som typisk bruges til at vurdere sårheling og generelle ændringer i cellemigration14,17. Mens de fleste laboratorier er udstyret til at foretage en ridse analyse, det udstyr, der anvendes til at spore celle migration tendens til enten at være utilgængelige eller for dyrt at købe. Dette omfatter time-lapse mikroskopi, som kræver en omvendt mikroskop og en levende billeddannelse system. Disse dyre stykker udstyr er ikke almindeligt tilgængelige for alle laboratorr. Derfor understreger denne observation behovet for en ny protokol, der gør det muligt at vurdere cellemigration med lettere tilgængeligt udstyr.
Den protokol, der præsenteres her, giver en ny og økonomisk overkommelig måde at vurdere cellemigrering på. Denne metode følger den samme procedure forbundet med ridse analyser, men adskiller sig i analysen af at undersøge celle migration ved at udnytte udstyr mere almindeligt tilgængelige i en grundlæggende videnskaber laboratorium indstilling. Denne protokol ved hjælp af fælles udstyr giver mulighed for en mere præcis bestemmelse af cellemigrering uden brug af time-lapse mikroskopi. Ud over at bestemme migrering tager denne metode også hensyn til variable faktorer i arbejdsområdet, som er blevet bemærket for at påvirke cellemigrering betydeligt. Samlet set giver denne nye protokol til cellemigreringsanalyse flere laboratorier mulighed for at udforske og bidrage til cellemigreringsområdet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne nye tilgang til scratch migration assay giver en mere tilgængelig metode for forskere til at undersøge ændringer i celle migration. Mens denne analyse følger den samme procedure for administration af en ridse svarende til andre ridser, det giver en ny metode til billeddannelse og nøjagtig analyse af celle migration10. I stedet for at bruge udstyrsintensive metoder til time-lapse-mikroskopi og levende cellebilleddannelseskamre beskriver denne metode brugen af almindeligt tilgængeligt la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af den amerikanske hær Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, University of Mississippi School of Pharmacy og Institut for BioMolekyrkulære Sciences.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
Referências
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
