Denne protokol præsenterer en tilgang til fingeraftryk og udforsker flerdimensionelle data indsamlet ved omfattende todimensionel gaskromatografi koblet til massespektrometri. Dedikerede mønstergenkendelsesalgoritmer (skabelonmatchning) anvendes til at udforske de kemiske oplysninger, der er krypteret i den ekstra jomfruelige olivenolie volatile fraktion (dvs. volatilome).
Databehandling og evaluering er kritiske trin i omfattende todimensionel gaskromatografi (GCxGC), især når det kombineres med massespektrometri. De rige oplysninger, der er krypteret i dataene, kan være meget værdifulde, men vanskelige at få effektiv adgang til. Datatæthed og kompleksitet kan føre til lange udarbejdelsestider og kræve besværlige, analytikerafhængige procedurer. Effektive, men tilgængelige databehandlingsværktøjer er derfor nøglen til at muliggøre spredning og accept af denne avancerede flerdimensionale teknik i laboratorier til daglig brug. Den dataanalyseprotokol, der præsenteres i dette arbejde, bruger kromatografiske fingeraftryk og skabelonmatchning til at nå målet om højt automatiseret dekonstruktion af komplekse todimensionale kromatogrammer i individuelle kemiske træk til avanceret genkendelse af informative mønstre inden for individuelle kromatogrammer og på tværs af sæt kromatogrammer. Protokollen giver høj konsistens og pålidelighed med lidt intervention. Samtidig er analytikeropsyn muligt i en række forskellige indstillinger og begrænsningsfunktioner, der kan tilpasses for at give fleksibilitet og kapacitet til at tilpasse sig forskellige behov og mål. Skabelon matching er vist her for at være en kraftfuld tilgang til at udforske ekstra jomfru olivenolie volatilome. Krydsjustering af toppe udføres ikke kun for kendte mål, men også for ikke-målrettede forbindelser, hvilket øger karakteriseringskraften betydeligt for en lang række applikationer. Eksempler præsenteres for dokumentation for ydeevnen for klassificering og sammenligning af kromatografiske mønstre fra prøvesæt, der analyseres under lignende forhold.
Omfattende todimensionel gaskromatografi kombineret med tid-of-flight massespektrometrisk detektion (GC×GC-TOF MS) er i dag den mest informative analytiske tilgang til kemisk karakterisering af komplekse prøver1,2,3,4,5. I GC×GC er kolonner serielt forbundet og forbundet med en modulator (f.eks. en termisk eller ventilbaseret fokusgrænseflade), der opfanger udringskomponenter fra den første dimension (1D) kolonne før deres genindsprøjtning i den anden dimension (2D) kolonne. Denne handling udføres inden for en fast gradueringsperiode (PM), der normalt varierer mellem 0,5-8 s. Ved termisk graduering omfatter processen kryo-fældefangst og fokusering af elutingbåndet med nogle fordele for den samlede adskillelseskraft.
Selvom GC×GC er en todimensionel separationsteknik, producerer processen sekventielle dataværdier. Detektoren analog-til-digital (A/D) konverter opnår kromatografisk signal output med en bestemt frekvens. Derefter gemmes data i specifikke proprietære formater, som ikke kun indeholder de digitaliserede data, men også relaterede metadata (oplysninger om dataene). Den A/D-konverter, der anvendes i GC×GC-systemer, hjælper med at kortlægge intensiteten af det kromatografiske signal til et digitalt nummer (DN) som en funktion af tiden i de to analytiske dimensioner. Enkeltkanalsdetektorer (f.eks. flammeioniseringsdetektor (FID), elektronfangstdetektor (ECD), svovl-chemiluminescensdetektor (SCD) frembringer enkelte værdier pr. prøvetagningstid, mens multikanaldetektorer (f.eks. massespektrometrisk detektor (MS)) frembringer flere værdier (typisk over et spektralområde) pr. prøvetagningstid langs analysekørslen.
Hvis du vil visualisere 2D-data, starter udarbejdelsen med rasterisering af en enkelt gradueringsperiode (eller cyklus) dataværdier som en kolonne med pixel (billedelementer, der svarer til detektorhændelser). Langs ordinaten (Y-aksen, nederst til toppen) visualiseres 2D-separationstiden. Pixelkolonner behandles sekventielt, så abscissa (X-aksen, venstre mod højre) rapporterer 1D-separationstid. Denne bestilling præsenterer 2D-dataene i et højrehåndet kartesisk koordinatsystem med 1D-opbevaringsordinær som det første indeks i matrixen.
Databehandling af 2D-kromatogrammer giver adgang til et højere informationsniveau end rådata, hvilket muliggør 2D-topdetektion, topidentifikation, udtræk af responsdata til kvantitativ analyse og krydskomparativ analyse.
2D-topmønstrene kan behandles som prøvens unikke fingeraftryk og detekteres forbindelser som minutiae-funktioner til effektiv krydssammenlignelig analyse. Denne tilgang, kendt som skabelonbaseret fingeraftryk6,7, var inspireret af biometriske fingeraftryk6. Automatiske biometriske fingeraftryk verifikationssystemer, i virkeligheden, stole på unikke fingerspids egenskaber: højderyg bifurcations og endelser, lokaliseret og udvundet af sværtede indtryk eller detaljerede billeder. Disse egenskaber, navngivne minutiae-funktioner, matches derefter på tværs af tilgængelige gemte skabeloner8,9.
Som nævnt ovenfor består hvert GC×GC-adskillelsesmønster af 2D-toppe rationelt fordelt over et todimensionelt plan. Hver top svarer til en enkelt analysand, har sit informative potentiale og kan behandles som et enkelt træk ved komparativ mønsteranalyse.
Her præsenterer vi en effektiv tilgang til kemiske fingeraftryk fra GC×GC-TOF MS med tandemionisering. Målet er at omfattende og kvantitativt katalog funktioner fra et sæt kromatogrammer.
Sammenlignet med eksisterende kommerciel software eller interne rutiner10,11, der anvender en top-features tilgang, skabelon-baseret fingeraftryk er kendetegnet ved høj specificitet, effektivitet og begrænset beregningstid. Derudover har den en iboende fleksibilitet, der muliggør krydsjustering af minutia-funktioner (dvs. 2D-toppe) mellem stærkt forkert justerede kromatogrammer som dem, der erhverves ved forskellige instrumentering eller i langtidsrammestudier12,13,14.
De grundlæggende operationer i den foreslåede metode er beskrevet kort for at guide læseren til en god forståelse af 2D mønster kompleksitet og information magt. Derefter udføres kemisk identifikation ved at udforske instrumentoutputdatamatrixen og kendte målrettede analysetter placeret over det todimensionale rum. Skabelonen for målrettede toppe bygges derefter og anvendes på en række kromatogrammer, der er erhvervet inden for samme analysebatch. Metadata relateret til opbevaringstider, spektralsignaturer og svar (absolutte og relative) udtrækkes fra omjusterede mønstre af målrettede toppe og vedtages for at afsløre kompositoriske forskelle i prøvesættet.
Som et yderligere, unikt trin i processen udføres der også et kombineret ikke-målrettet og målrettet (UT) fingeraftryk på forudbestemte kromatogrammer for at udvide fingeraftrykspotentialet til både kendte og ukendte analysetter. Processen producerer en UT-skabelon til en virkelig omfattende komparativ analyse, der stort set kan automatiseres.
Som et sidste skridt udfører metoden krydsjusteringen af funktioner i to parallelle detektorsignaler produceret med høj og lav elektronioniseringsenergi (70 og 12 eV).
Protokollen er ret fleksibel med hensyn til understøttende analyser af et enkelt kromatogram eller et sæt kromatogrammer og med variabel kromatografi og/eller flere detektorer. Her demonstreres protokollen med en kommercielt tilgængelig GC×GC Software suite (se Materialetabel)kombineret til et MS-bibliotek og søgesoftware (se Materialeoversigt). Nogle af de nødvendige værktøjer er tilgængelige i anden software , og lignende værktøjer kan implementeres uafhængigt af beskrivelser i litteraturen af Reichenbach og kolleger15,16,17,18,19. Rå data til demonstrationen stammer fra en forskningsundersøgelse af ekstra jomfruolie (EVO) udført i forfatternes laboratorium14. Især udtages der prøver af den flygtige fraktion (dvs. volatilome) af italienske EVO-olier efter mikroextraktion i hovedrumskulostret (HS-SPME) og analyseres af GC×GC-TOF MS for at opfange diagnostiske fingeraftryk for at opnå kvalitet og sensorisk kvalificering af prøver. Nærmere oplysninger om prøver, prøveudtagningsbetingelser og analyseopsætning findes i materialeoversigten.
Trin 1-6 beskriver forbehandling af kromatogrammer. Trin 7-9 beskriver behandling og analyse af individuelle kromatogrammer. Trin 10-12 beskriver oprettelse og sammenholdelse af skabeloner, som danner grundlag for analyse på tværs af stikprøver. Trin 13-16 beskriver anvendelse af protokollen på tværs af et sæt kromatogrammer med trin 14-16 til UT-analyse.
Visualisering af GC×GC-TOF MS-data er et grundlæggende skridt for en passende forståelse af de resultater, der opnås ved omfattende todimensionelle separationer. Billedplotter med tilpasset farvelægning gør det muligt for analytikere at sætte pris på detektorresponsforskelle og dermed differentialfordelingen af prøvekomponenter. Denne visuelle tilgang ændrer fuldstændigt analytikernes perspektiv på fortolkning og udarbejdelse af kromatogrammer. Dette første skridt, der engang blev forstået og trygt brugt af kromatografer, åbner et nyt perspektiv i yderligere behandling.
Et andet grundlæggende aspekt ved databehandling er tilgængeligheden til den fulde datamatrix (dvs. MS-spektraldata og -svar) for alle prøvepunkter, som hver især svarer til en enkelt detektorhændelse. I denne henseende topper 2D integrationen, således at indsamlingen af detektorhændelser svarende til en enkelt analysand udgør et kritisk skridt. I den nuværende protokol er 2D toppedetektering baseret på vandskelletalgoritme 18 med nogle tilpasninger inkluderet for at forbedre detektionsfølsomheden i tilfælde af delvise co-eluting forbindelser. For at gøre denne proces mere specifik skal der gøres en dekonvolution, og der skal vedtages mere avancerede procedurer. Dette er muligt ved at udføre en iontopregistrering for MS-data. algoritmen behandler datamatrixen og isolerer svaret fra enkelte analysetter baseret på spektralprofilerne19,31.
Et vigtigt, men kritisk skridt i protokollen og i enhver GC×GC-MS-datafortolkningsproces vedrører identifikation af analysater. Denne procedure, der foreslås i trin 8 og 9, skal i mangel af en bekræftende analyse med autentiske standarder omhyggeligt udføres af analytikeren. Automatiserede handlinger er tilgængelige i enhver kommerciel software; de omfatter ms spektral signatur lighedsvurdering i forhold til de indsamlede referencespektre (dvs. spektralbiblioteker) og evaluering af karakteristiske forhold mellem kvalifikations-/kvantificerioner. Der er dog behov for yderligere verifikationskriterier for at fjerne identifikationen af isomerer. I protokollen foreslås det, at der vedtages lineære fastholdelsesindekser for at prioritere listen over kandidater. grænsen her vedrører tilgængeligheden af opbevaringsdata og dens konsistens.
Den vigtigste egenskab, der gør denne tilgangunik,er skabelon, der matcher12,13,15,29. Skabelonmatchning muliggør 2D mønstergenkendelse på en meget effektiv, specifik og intuitiv måde. Det kan indstilles med hensyn til følsomhed og specificitet ved at anvende tilpassede tærskelværdier og/eller begrænsningsfunktioner, mens analytikeren kan overvåge proceduren ved aktivt at interagere med transformeringsfunktionsparametre. Denne process egenart afhænger af muligheden for at krydsjustere oplysninger om målrettede og ikke-målrettede toppe mellem prøver af et ensartet parti, men også mellem prøver, der er udtaget med de samme nominelle forhold på trods af medium-til-alvorlig forskydning. Fordelene ved denne operation vedrører muligheden for at bevare alle målrettede analysandidentifikationer, hvilket er en tidskrævende opgave for analytikeren, og alle metadata, der er gemt til målrettede og ikke-målrettede toppe fra tidligere udarbejdelsessessioner.
Skabelonmatchning er også meget effektiv med hensyn til beregningstid; MS-datafiler med lav opløsning består af ca. 1-2 Gb pakkede data, mens MS-analyser med høj opløsning kan nå op på 10-15 Gb pr. enkelt analysekørsel. Skabelonmatchning behandler ikke den fulde datamatrix hver gang, men udfører først tilpasning af retentionstid mellem kromatogrammer ved hjælp af skabelontoppe, hvorefter kandidattoppe i søgevinduet for deres lighed matcher med referencen i skabelonen. I tilfælde af alvorlig forskydning, den mest udfordrende situation, klarede globale andenrangs polynomiske transformeringer sig bedre end lokale metoder, samtidig med at beregningstiden13reduceres .
For at GC×GC-teknikken kan sprede sig bredt ud over den akademiske verden og forskningslaboratorier, skal databehandlingsværktøjer lette grundlæggende operationer til visualisering og kromatograminspektion; identifikation af analysater bør give mulighed for at anvende standardiserede algoritmer og procedurer (f.eks. NIST-søgealgoritme og IT-kalibrering); og krydssammenlignelig analyse bør være intuitiv, effektiv og understøttet af interaktive værktøjer. Den foreslåede tilgang imødekommer disse behov, samtidig med at den tilbyder avancerede muligheder og værktøjer til at håndtere komplekse situationer såsom analytisk medhjælpning, kalibrering af flere analysater, gruppetypeanalyse og parallel detektionsjustering.
Den refererede litteratur dækker godt mange mulige scenarier, hvor GC×GC og mere generelt omfattende todimensionel kromatografi tilbyder unikke løsninger og pålidelige resultater, der ikke kan opnås ved 1D-kromatografi i enkeltløbsanalyse. 5,32,33 Selvom GC×GC er det mest kraftfulde værktøj, der øger adskillelseskapaciteten og følsomheden, er der altid begrænsninger for separationskraft, følsomhed og andre systemiske kapaciteter. Efterhånden som disse systemiske grænser nærmer sig, bliver dataanalysen gradvist vanskeligere. Derfor skal forskning og udvikling fortsat forbedre de analytiske værktøjer, vi har til rådighed.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen blev støttet af Progetto Ager − Fondazioni i rete per la ricerca agroalimentare. Projekt akronym Violin – Valorisering af italienske olivenprodukter gennem innovative analytiske værktøjer (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). GC Image software er tilgængelig for en gratis prøveperiode for læsere, der ønsker at demonstrere og teste protokollen.
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager – Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |