Summary

Обнаружение экспрессии микроРНК в почках мышей-нефропатических иммуноглобулинов А

Published: July 08, 2020
doi:

Summary

микроРНК участвуют в патогенезе IgA-нефропатии. Мы разработали надежный метод определения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели IgA-нефропатии (мыши HIGA). Этот новый метод облегчит проверку участия микроРНК в IgA-нефропатии.

Abstract

Иммуноглобулиновая нефропатия А (IgA) – это тип первичного гломерулонефрита, характеризующийся аномальным отложением IgA, приводящим к терминальной стадии почечной недостаточности. В последние годы сообщалось об участии микроРНК (миРНК) в патогенезе IgA-нефропатии. Однако не существует установленного метода профилирования микроРНК при IgA-нефропатии с использованием моделей мелких животных. Поэтому мы разработали надежный метод анализа микроРНК в почках мышиной модели IgA (мышь HIGA). Целью этого протокола является обнаружение измененных уровней экспрессии микроРНК в почках мышей HIGA по сравнению с уровнями в почках контрольных мышей. Вкратце, этот метод состоит из четырех этапов: 1) получение образцов почек от мышей HIGA; 2) очистка общей РНК из образцов почек; 3) синтез комплементарной ДНК из общей РНК; и 4) количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (qRT-PCR) микроРНК. Используя этот метод, мы успешно определили уровни экспрессии нескольких микроРНК (miR-155-5p, miR-146a-5p и miR-21-5p) в почках мышей HIGA. Этот новый метод может быть применен к другим исследованиям, профилирующим микроРНК при IgA-нефропатии.

Introduction

Иммуноглобулиновая нефропатия А (IgA) представляет собой тип первичного гломерулонефрита, характеризующийся аномальным отложением IgA в почечной клубочковой мезангиальной области 1,2. Он является наиболее распространенным из первичных гломерулонефритов и приводит к терминальной стадии почечной недостаточности у 20–40% пациентов2. Причина до сих пор неизвестна, но была зафиксирована персистирующая инфекция слизистой оболочки 1,3. Кортикостероиды, иммунодепрессанты и ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы были предложены в качестве терапевтических методов1,3, но не были полностью установлены 3. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для уточнения этиологии и терапевтических методов лечения IgA-нефропатии.

микроРНК (миРНК) представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов 4,5. Сообщается, что микроРНК участвуют в патогенезе различных заболеваний, и некоторые из них были идентифицированы как биомаркеры заболеваний и терапевтические агенты 4,5. В последние годы также сообщалось о связи между микроРНК и патогенезом IgA-нефропатии 2,6,7. Например, было показано, что miR-148b участвует в структурных аномалиях IgA у пациентов с IgA-нефропатией 2,6,7, в то время как miR-148b и let-7b были задокументированы как новые биомаркеры для выявления IgA-нефропатии7. Хотя понимание влияния микроРНК на IgA-нефропатию может помочь в дальнейшем выяснении этиологии и лечения 2, стандартные методы профилирования микроРНК при IgA-нефропатии с использованием моделей мелких животных еще не установлены2.

Здесь мы разработали простой и надежный метод измерения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели нефропатии IgA (мыши HIGA). Мышь HIGA представляет собой характерный штамм ddY, демонстрирующий особенно высокий уровень сывороточного IgA и аномальное отложение IgA в почечных клубочках 8,9,10,11. Таким образом, мышей HIGA можно использовать в качестве мышиной модели нефропатии IgA 8,9,10,11. Наш метод состоит из четырех основных этапов: во-первых, хирургическое получение образцов почек от мышей HIGA; во-вторых, гомогенизация образцов и очистка общей РНК с использованием спиновой колонки на основе кремнеземной мембраны; в-третьих, синтез комплементарной ДНК (кДНК) из общей РНК с использованием обратной транскрипции; и, в-четвертых, определение уровней экспрессии микроРНК с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Обоснование этого метода и достоверность результатов основаны на предыдущих отчетах12,13. Мы показываем, что это полезный метод для точного измерения уровней экспрессии микроРНК в мышиной модели нефропатии IgA, и что он может быть использован для облегчения будущих исследований микроРНК при нефропатии IgA.

Protocol

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Цзичи и соответствуют рекомендациям по использованию и уходу за экспериментальными животными из Руководства Медицинского университета Джичи для лабораторных животных. 1. Полу…

Representative Results

Мы исследовали уровни экспрессии микроРНК в почках мышей HIGA (n=10). Этот результат был получен полностью на основе описанного протокола. В качестве контрольной были выбраны почки мышей Balb/c (n=10). В обеих группах были отобраны люди в возрасте 25 недель. У поставщика были доступны только самки …

Discussion

Мы смогли измерить уровни экспрессии микроРНК в почках мышиной модели нефропатии IgA (мыши HIGA) с помощью этого нового метода. IgA-нефропатия является необъяснимым заболеванием, которое нуждается в дальнейших исследованиях для уточнения его этиологии и терапевтических целей

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Сару Уильямс, доктора философии из Edanz Group (www.edanzediting.com) за редактирование черновика этой рукописи.

Materials

BALB/cCrSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female) Japan SLC, Inc. none IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit Qiagen 218161 Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2) Qiagen MS00033740 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p) Qiagen MS00001701 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p) Qiagen MS00001638 miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p) Qiagen MS00009079 miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder Qiagen 79654 biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 real-time PCR instrument software
takara biomasher standard Takara Bio 9790B silicon homogenizer

Referências

  1. Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
  2. Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
  3. Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
  4. Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
  5. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
  6. Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
  7. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  8. Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
  9. Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
  10. Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
  11. Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  14. Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
  15. Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
  16. Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).

Play Video

Citar este artigo
Kaneko, S., Yanai, K., Ishii, H., Aomatsu, A., Ito, K., Hirai, K., Ookawara, S., Ishibashi, K., Morishita, Y. Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice. J. Vis. Exp. (161), e61535, doi:10.3791/61535 (2020).

View Video