Rilevazione dell'espressione di microRNA nei reni di topi nefropatici con immunoglobuline A
Summary
I microRNA sono coinvolti nella patogenesi della nefropatia da IgA. Abbiamo sviluppato un metodo affidabile per rilevare i livelli di espressione di microRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Questo nuovo metodo faciliterà il coinvolgimento dei miRNA nella nefropatia da IgA.
Abstract
La nefropatia da immunoglobuline A (IgA) è un tipo di glomerulonefrite primaria caratterizzata dalla deposizione anomala di IgA, che porta all’insufficienza renale allo stadio terminale. Negli ultimi anni, il coinvolgimento dei microRNA (miRNA) è stato riportato nella patogenesi della nefropatia da IgA. Tuttavia, non esiste un metodo stabilito per profilare i miRNA nella nefropatia da IgA utilizzando modelli di piccoli animali. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per analizzare i miRNA nel rene di un modello murino IgA (topo HIGA). L’obiettivo di questo protocollo è rilevare i livelli di espressione alterati dei miRNA nei reni dei topi HIGA rispetto ai livelli nei reni dei topi di controllo. In breve, questo metodo consiste in quattro passaggi: 1) ottenere campioni di rene dai topi HIGA; 2) purificazione dell’RNA totale da campioni renali; 3) sintetizzare DNA complementare dall’RNA totale; e 4) reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa (qRT-PCR) dei miRNA. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato con successo i livelli di espressione di diversi miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p) nei reni dei topi HIGA. Questo nuovo metodo può essere applicato ad altri studi che profilano i miRNA nella nefropatia da IgA.
Introduction
La nefropatia da immunoglobuline A (IgA) è un tipo di glomerulonefrite primitiva caratterizzata dalla deposizione anomala di IgA nella regione mesangiale glomerulare renale 1,2. È la più comune delle glomerulonefriti primarie e porta all’insufficienza renale allo stadio terminale nel 20%-40% dei pazienti2. La causa è ancora sconosciuta, ma è stata implicata un’infezione persistente della mucosa 1,3. Corticosteroidi, immunosoppressori e inibitori del sistema renina-angiotensina sono stati proposti come metodi terapeutici1,3, ma non sono stati completamente stabiliti 3. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire l’eziologia e i metodi terapeutici di trattamento della nefropatia da IgA.
I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti che svolgono un ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica 4,5. I miRNA sono coinvolti nella patogenesi di varie malattie e alcuni sono stati identificati come biomarcatori di malattia e agenti terapeutici 4,5. Negli ultimi anni è stata riportata anche un’associazione tra miRNA e patogenesi della nefropatia da IgA 2,6,7. Ad esempio, miR-148b ha dimostrato di essere coinvolto nelle anomalie strutturali delle IgA nei pazienti con nefropatia da IgA 2,6,7, mentre miR-148b e let-7b sono stati documentati come nuovi biomarcatori per rilevare la nefropatia da IgA7. Sebbene la comprensione degli effetti dei miRNA sulla nefropatia da IgA possa aiutare a chiarire ulteriormente l’eziologia e il trattamento 2, non sono ancora stati stabiliti metodi standard per la profilazione dei miRNA nella nefropatia da IgA utilizzando modelli di piccoli animali2.
Abbiamo sviluppato un metodo semplice e affidabile per misurare i livelli di espressione dei miRNA nei reni di un modello murino di nefropatia IgA (topi HIGA). Il topo HIGA è un ceppo ddY caratteristico che mostra un livello particolarmente elevato di IgA sieriche e la deposizione anomala di IgA nei glomeruli renali 8,9,10,11. Pertanto, i topi HIGA possono essere utilizzati come un modello murino per nefropatia IgA 8,9,10,11. Il nostro metodo consiste in quattro fasi principali: in primo luogo, ottenere chirurgicamente campioni di rene da topi HIGA; in secondo luogo, omogeneizzare i campioni e purificare l’RNA totale utilizzando una colonna di spin basata su membrana di silice; terzo, sintetizzare DNA complementare (cDNA) dall’RNA totale utilizzando la trascrizione inversa; e quarto, rilevare i livelli di espressione dei miRNA mediante reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa (qRT-PCR). La logica di questo metodo e l’affidabilità dei risultati si basano sulle relazioni precedenti12,13. Mostriamo che questa è una tecnica utile per misurare con precisione i livelli di espressione dei miRNA in un modello murino di nefropatia da IgA e che potrebbe essere utilizzata per facilitare la ricerca futura sui miRNA nella nefropatia da IgA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siamo stati in grado di misurare i livelli di espressione dei miRNA nei reni di un modello murino di nefropatia da IgA (topi HIGA) utilizzando questo nuovo metodo. La nefropatia da IgA è una malattia inspiegabile che necessita di ulteriori ricerche per chiarirne l’eziologia e gli obiettivi terapeutici 1,3. Tuttavia, ottenere campioni di rene umano è altamente invasivo. Questa nuova tecnica è vantaggiosa in quanto consente lo studio della nefropatia da IgA util…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Sarah Williams, PhD, di Edanz Group (www.edanzediting.com) per aver curato una bozza di questo manoscritto.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
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