Detecção da Expressão de MicroRNA nos Rins de Camundongos Nefropáticos com Imunoglobulina A
Summary
microRNAs estão envolvidos na patogênese da nefropatia por IgA. Desenvolvemos um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). Este novo método facilitará a verificação do envolvimento de miRNAs na nefropatia por IgA.
Abstract
A nefropatia por imunoglobulina A (IgA) é um tipo de glomerulonefrite primária caracterizada pela deposição anormal de IgA, levando à insuficiência renal terminal. Nos últimos anos, o envolvimento de microRNAs (miRNAs) tem sido relatado na patogênese da nefropatia por IgA. No entanto, não há um método estabelecido para perfilar miRNAs na nefropatia por IgA usando modelos de pequenos animais. Portanto, desenvolvemos um método confiável para analisar miRNA no rim de um modelo de camundongo IgA (camundongo HIGA). O objetivo deste protocolo é detectar os níveis alterados de expressão de miRNAs nos rins de camundongos HIGA quando comparados com os níveis em rins de camundongos controle. Em resumo, esse método consiste em quatro etapas: 1) obtenção de amostras de rim de camundongos HIGA; 2) purificação do RNA total das amostras de rim; 3) sintetizar DNA complementar a partir de RNA total; e 4) reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) de miRNAs. Usando este método, detectamos com sucesso os níveis de expressão de vários miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p) nos rins de camundongos HIGA. Este novo método pode ser aplicado a outros estudos de perfil de miRNAs na nefropatia por IgA.
Introduction
A nefropatia por imunoglobulina A (IgA) é um tipo de glomerulonefrite primária caracterizada pela deposição anormal de IgA na região mesangial glomerular renal 1,2. É a mais comum das glomerulonefrites primárias e leva à insuficiência renal terminal em 20%–40% dos pacientes2. A causa ainda é desconhecida, mas infecção mucosa persistente tem sido implicada 1,3. Corticosteroides, imunossupressores e inibidores do sistema renina−angiotensina têm sido propostos como métodos terapêuticos1,3, mas não estão completamente estabelecidos 3. Portanto, mais pesquisas são necessárias para esclarecer a etiologia e os métodos terapêuticos do tratamento da nefropatia por IgA.
microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que desempenham um papel importante na regulação da expressão gênica 4,5. Há relatos de que os miRNAs estão envolvidos na patogênese de várias doenças, e alguns têm sido identificados como biomarcadores e agentes terapêuticosda doença4,5. Nos últimos anos, uma associação entre miRNAs e a patogênese da nefropatia por IgA também tem sido relatada 2,6,7. Por exemplo, demonstrou-se que o miR-148b está envolvido em anormalidades estruturais da IgA em pacientes com nefropatia por IgA 2,6,7, enquanto o miR-148b e o let-7b foram documentados como novos biomarcadores para detecção de nefropatia por IgA7. Embora a compreensão dos efeitos dos miRNAs na nefropatia por IgA possa ajudar a elucidar melhor a etiologia e o tratamento 2, métodos padrão para o perfil de miRNAs na nefropatia por IgA usando modelos de pequenos animais ainda não foram estabelecidos2.
Desenvolvemos um método simples e confiável para medir os níveis de expressão de miRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). O camundongo HIGA é uma cepa ddY característica, apresentando um nível particularmente alto de IgA sérica e deposição anormal de IgA em glomérulos renais 8,9,10,11. Portanto, camundongos HIGA podem ser usados como modelo de nefropatia por IgAem camundongos 8,9,10,11. Nosso método consiste em quatro etapas principais: primeiro, a obtenção cirúrgica de amostras de rim de camundongos HIGA; segundo, homogeneizar amostras e purificar o RNA total usando uma coluna de spin baseada em membrana de sílica; terceiro, sintetizar DNA complementar (cDNA) a partir de RNA total usando transcrição reversa; e quarto, detecção dos níveis de expressão de miRNA por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). A justificativa para esse método e a confiabilidade dos resultados são baseadas em relatos anteriores12,13. Mostramos que esta é uma técnica útil para medir com precisão os níveis de expressão de miRNA em um modelo de nefropatia por IgA em camundongos, e que poderia ser usada para facilitar pesquisas futuras sobre miRNAs na nefropatia por IgA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Conseguimos medir os níveis de expressão de miRNAs nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA) usando este novo método. A nefropatia por IgA é uma doença inexplicada que necessita de mais pesquisas para esclarecer sua etiologia e alvosterapêuticos1,3. No entanto, a obtenção de amostras de rim humano é altamente invasiva. Essa nova técnica é vantajosa na medida em que permite o estudo da nefropatia por IgA em pequenos a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sarah Williams, PhD, do Edanz Group (www.edanzediting.com) pela edição de um rascunho deste manuscrito.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
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