Detektion av mikroRNA-uttryck i njurarna av immunglobulin, en nefropatisk möss
Summary
mikroRNA är involverade i patogenesen av IgA-nefropati. Vi har utvecklat en tillförlitlig metod för att detektera mikroRNA-uttrycksnivåer i njurarna hos en IgA-nefropatimusmodell (HIGA-möss). Denna nya metod kommer att underlätta för att kontrollera miRNAs engagemang i IgA-nefropati.
Abstract
Immunoglobulin A (IgA) nefropati är en typ av primär glomerulonefrit som kännetecknas av onormal avsättning av IgA, vilket leder till njursvikt i slutstadiet. Under de senaste åren har involvering av mikroRNA (miRNA) rapporterats i patogenesen av IgA-nefropati. Det finns dock ingen etablerad metod för profilering av miRNA i IgA-nefropati med hjälp av smådjursmodeller. Därför utvecklade vi en tillförlitlig metod för att analysera miRNA i njuren i en IgA-musmodell (HIGA-mus). Målet med detta protokoll är att detektera de förändrade uttrycksnivåerna av miRNA i njurarna hos HIGA-möss jämfört med nivåerna i njurarna hos kontrollmöss. I korthet består denna metod av fyra steg: 1) erhålla njurprover från HIGA-möss; 2) rening av totalt RNA från njurprover; 3) syntetisera komplementärt DNA från totalt RNA; och 4) kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR) av miRNA. Med hjälp av denna metod upptäckte vi framgångsrikt uttrycksnivåerna för flera miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p och miR-21-5p) i njurarna hos HIGA-möss. Denna nya metod kan tillämpas på andra studier som profilerar miRNA i IgA-nefropati.
Introduction
Immunoglobulin A (IgA) nefropati är en typ av primär glomerulonefrit som kännetecknas av onormal avsättning av IgA i den renala glomerulära mesangialregionen 1,2. Det är den vanligaste av de primära glomerulonefrit och leder till njursvikt i slutstadiet hos 20% -40% av patienterna2. Orsaken är fortfarande okänd men ihållande slemhinneinfektion har varit inblandad 1,3. Kortikosteroider, immunsuppressiva medel och renin-angiotensinsystemhämmare har föreslagits som terapeutiska metoder1,3, men har inte helt fastställts3. Därför krävs ytterligare forskning för att klargöra etiologin och terapeutiska metoder för behandling av IgA-nefropati.
mikroRNA (miRNA) är små, icke-kodande RNA som spelar en viktig roll för att reglera genuttryck 4,5. miRNA rapporteras vara involverade i patogenesen av olika sjukdomar, och vissa har identifierats som sjukdomsbiomarkörer och terapeutiska medel 4,5. Under de senaste åren har ett samband mellan miRNA och patogenesen av IgA-nefropati också rapporterats 2,6,7. Till exempel visade sig miR-148b vara involverad i strukturella abnormiteter av IgA hos patienter med IgA-nefropati 2,6,7, medan miR-148b och let-7b dokumenterades som nya biomarkörer för att detektera IgA-nefropati7. Även om förståelse av effekterna av miRNA på IgA-nefropati kan hjälpa till att ytterligare belysa etiologi och behandling 2, har standardmetoder för profilering av miRNA i IgA-nefropati med hjälp av smådjursmodeller ännu inte fastställts2.
Vi utvecklade häri en enkel och tillförlitlig metod för att mäta miRNA-uttrycksnivåer i njurarna hos en IgA-nefropatimusmodell (HIGA-möss). HIGA-musen är en karakteristisk ddY-stam som visar en särskilt hög nivå av serum-IgA och onormal avsättning av IgA i njurglomeruli 8,9,10,11. Därför kan HIGA-möss användas som en IgA-nefropati mus modell 8,9,10,11. Vår metod består av fyra huvudsteg: först, kirurgiskt erhållande av njurprover från HIGA-möss; för det andra, homogenisering av prover och rening av totalt RNA med användning av en kiseldioxidmembranbaserad spinnkolonn; för det tredje, syntetisera komplementärt DNA (cDNA) från totalt RNA med användning av omvänd transkription; och för det fjärde detektering av expressionsnivåerna av miRNA genom kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR). Motiveringen för denna metod och resultatens tillförlitlighet baseras på tidigare rapporter12,13. Vi visar att detta är en användbar teknik för att noggrant mäta miRNA-uttrycksnivåer i en IgA-nefropati-musmodell, och att den kan användas för att underlätta framtida forskning om miRNA i IgA-nefropati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi kunde mäta uttrycksnivåerna av miRNA i njurarna hos en IgA-nefropatimusmodell (HIGA-möss) med hjälp av denna nya metod. IgA-nefropati är en oförklarlig sjukdom som behöver ytterligare forskning för att klargöra dess etiologi och terapeutiska mål 1,3. Att få mänskliga njurprover är dock mycket invasivt. Denna nya teknik är fördelaktig eftersom den möjliggör studier av IgA-nefropati med hjälp av små djur och bör underlätta framtida forskning…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Sarah Williams, PhD, från Edanz Group (www.edanzediting.com) för att redigera ett utkast till detta manuskript.
Materials
| BALB/cCrSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | Mouse for control |
| HIGA/NscSlc (25-week-old, female) | Japan SLC, Inc. | none | IgA nephropathy mouse model |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Experimental kit for synthesis of cDNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Experimental kit fot extraction of total RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638 | miRNA-specific primer |
| miScript Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | miRNA-specific primer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Experimental kit for real-time PCR |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding spin column |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | silicon homogenizer |
Referências
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
- Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
- Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
- Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
- Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
- Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).
- Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
- Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
- Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
- Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. . How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).
