इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य यह है कि व्यक्तियों के सेरा या प्लाज्मा में मौजूद एंटीबॉडी की क्षमता को मापने के तरीके पर निर्देश प्रदान किया जाए, स्वाभाविक रूप से प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमण के संपर्क में, परजीवी संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स (आईईएस) के फागोसिटोसिस को उजागर करने के लिए।
प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि वीएआर2सीएसए के लिए विशिष्ट स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत आईजीजी एंटीबॉडी द्वारा अनुमानित प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम-संक्रमितएरिथ्रोसाइट्स (आईईएस) के प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित फैगोसाइटोसिस परख को कैसे स्थापित किया जाए और चलाया जाए। VAR2CSA परजीवी एंटीजन है जो प्लेसेंटा में आईईएस के चयनात्मक ज़ब्ती का मध्यस्थता करता है जो गर्भवती महिलाओं में मलेरिया के गंभीर रूप का कारण बन सकता है, जिसे अपरा मलेरिया (पीएम) कहा जाता है। प्रधानमंत्री से सुरक्षा VAR2CSA-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो अपरा ज़ब्ती को रोककर कार्य करने के लिए माना जाता है और/या phagocytosis के लिए iEs opsonizing द्वारा । परख देर से मंच सिंक्रोनाइज्ड आईईएस को रोजगार देती है जिसे वीआर2सीएसए, प्लाज्मा/सीरम-एंटीबॉडी को स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत पीएम-विशिष्ट प्रतिरक्षा और फैगोसाइटिक सेल लाइन टीएचपी-1 के साथ महिलाओं से व्यक्त करने के लिए विट्रो में चुना गया है । हालांकि, प्रोटोकॉल को आसानी से आईई सतह पर मौजूद किसी भी परजीवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की कार्यक्षमता को परखने के लिए संशोधित किया जा सकता है, चाहे वह प्राकृतिक जोखिम से प्रेरित हो या टीकाकरण द्वारा। परख मलेरिया में एंटीबॉडी-मध्यस्थता प्रतिरक्षा के एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक पहलू के अच्छे प्रजनन क्षमता के साथ सरल और उच्च थ्रूपुट मूल्यांकन प्रदान करती है। इसलिए, यह उपयोगी है जब पी फाल्सीपेरम मलेरिया के लिए नैदानिक प्रतिरक्षा का मूल्यांकन, विशेष रूप से उप सहारा अफ्रीका में उष्णकटिबंधीय में रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है ।
मलेरिया एक वेक्टर जनित रोग है जो मनुष्यों में प्लाज्मोडियमजीनस की पांच विभिन्न प्रजातियों के साथ संक्रमण पर होता है । सबसे प्रचलित प्रजाति पी फाल्सीपेरमहै , जो सबसे अधिक रुग्णता और मृत्यु दर के लिए भी जिम्मेदार है1. मलेरिया नैदानिक प्रस्तुति स्पर्शोन्मुख या सौम्य संक्रमण से जटिल/गंभीर बीमारी के लिए बदलता है, बाद में ज्यादातर पांच साल से कम आयु के बच्चों में होने वाली । पी फाल्सीपेरम के संपर्क में आने से बाँझ प्रतिरक्षा पैदा नहीं होती है, लेकिन स्थानिक क्षेत्रों में रहने वाले व्यक्ति धीरे-धीरे नैदानिक रोग के खिलाफ प्रतिरक्षा विकसित करते हैं। संरक्षण आयु/जोखिम निर्भर है और प्रतिरक्षा आम तौर पर जीवन के पहले 5-10 वर्षों के दौरान प्राप्त की है2। वयस्क महिलाएं एक महत्वपूर्ण अपवाद हैं, क्योंकि गर्भावस्था के दौरान एक नैदानिक प्रस्तुति में गंभीर मलेरिया हो सकता है जिसे अपरा मलेरिया (पीएम) के रूप में जाना जाता है। पीएम गर्भपात, प्रसव, समय से पहले प्रसव, जन्म के समय में कम वजन, भ्रूण मृत्यु और मातृ एनीमिया का एक महत्वपूर्ण कारण है। प्रधानमंत्री के प्रति प्रतिरोध लगातार गर्भधारण पर विकसित3. प्रधानमंत्री से सुरक्षा VAR2CSA-प्रकार PfEMP14,,5,एक संक्रमित एरिथ्रोसाइट (आईई) सतह एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के अधिग्रहण से जुड़ी हुई है जो कोनड्रोइटिन सल्फेट ए (सीएसए) को बांधती है जो प्लेसेंटा में आईई ज़ब्ती को सक्षम करती है। एंटीबॉडी विभिन्न कार्यात्मक गतिविधियों(6,,7में समीक्षा) प्रदर्शन करने वाले सुरक्षा में मध्यस्थता करते हैं, जिसमें फागोसाइटोसिस को प्रेरित करने के लिए आईईएस का opsonization शामिल है। शुरुआती विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि एंटीबॉडी फागोसाइटोसिस 8,9के माध्यम से मोनोसाइट्स की उपस्थिति में पी फाल्सीपेरम वृद्धि को सीमित करसकतेहैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि फागोसिटोसिस-उत्प्रेरण एंटीबॉडी के उच्च स्तर बेहतर गर्भावस्था परिणामों (एचआईवी सह-संक्रमण के संदर्भ में)10, 11,से जुड़ेहोतेहैं, जो स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में इस प्रभावक कार्य की प्रासंगिकता को दर्शाता है।
यहां हम मानव प्लाज्मा/सीरम में मौजूद एंटीबॉडी के इस कार्य को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इन विट्रो सुसंस्कृत आईईएस का उपयोग करके मोनोसाइट लाइन टीएचपी-1 के साथ VAR2CSA व्यक्त करते हैं । परख का उपयोग पहले,11, 12,,13,,14, 15,13,16,,17,,,18किया गया है और इसे पहले के माइक्रोस्कोप-आधारित प्रोटोकॉल8की तुलना में एक बेहतर और आसान दृष्टिकोण माना जाता है, क्योंकि यह एंटीबॉडी की छोटी मात्रा का उपयोग करके एक ही रन में बड़ी संख्या में एंटीबॉडी नमूनों के परीक्षण की अनुमति देता है और थकाऊ पूर्वाग्रह और सूक्ष्मकॉपी गणना से बचता है।18 हालांकि परख कई प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है और इसके निष्पादन काफी सरल है, यह सावधान योजना और तैयारी की आवश्यकता है, इसलिए, एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रयोगशालाओं और पिछले अनुभव की कमी शोधकर्ताओं द्वारा अपने आवेदन की अनुमति होगी । हम एक उदाहरण के रूप में, देर से चरण-सिंक्रोनाइज्ड आईईएस का उपयोग करते हैं, जो स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत पीएम-विशिष्ट प्रतिरक्षा के साथ महिलाओं से एकत्र सीरम में मौजूद एंटीबॉडी के साथ OPsonized VAR2CSA व्यक्त करते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल को आसानी से आईई सतह पर मौजूद किसी भी परजीवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की कार्यक्षमता को परखने के लिए संशोधित किया जा सकता है, चाहे वह प्राकृतिक जोखिम से प्रेरित हो या टीकाकरण द्वारा।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को पहले वर्णित किया गया है और12,15, 17,,31 का उपयोग किया गया है ताकि टीएचपी-1 कोशिकाओं द्वारा opsonization और फैगोसाइटोसिस को प्रेरित करने के लिए पी फाल्सीपेरम आईईएस ?…
The authors have nothing to disclose.
मैकेन विस्ती को उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया जाता है। इस कार्य को आंशिक रूप से डेनमार्क के विदेश मंत्रालय से अनुदान (MAVARECA II; 17-02-केयू) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और दानिडा फैलोशिप सेंटर द्वारा प्रशासित किया गया था । फंडर का अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।
96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
DPBS | Sigma | P8622 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |