Det övergripande målet med detta protokoll är att ge instruktioner om hur man mäter kapaciteten hos antikroppar som finns i sera eller plasma av individer, naturligt utsatt för Plasmodium falciparum infektion, att opsonize och inducera fagocytos av parasitinfekterade erytrocyter (IEs).
Protokollet beskriver hur man ställer in och kör ett flöde cytometry-baserade fagocytos analys av Plasmodium falciparum-infekterade erytrocyter (IEs) opsonized av naturligt förvärvade IgG antikroppar specifika för VAR2CSA. VAR2CSA är parasiten antigen som förmedlar selektiv kvarstad av IEs i moderkakan som kan orsaka en allvarlig form av malaria hos gravida kvinnor, kallas placenta malaria (PM). Skydd från PM medieras av VAR2CSA-specifika antikroppar som tros fungera genom att hämma placentabindning och/eller genom att opsonisera IEs för fagocytos. Analysen sysselsätter sent stadium-synkroniserade IEs som har valts in vitro för att uttrycka VAR2CSA, plasma/serum-antikroppar från kvinnor med naturligt förvärvade PM-specifika immunitet, och den fagocytic cellinje THP-1. Protokollet kan dock lätt modifieras för att analysera funktionaliteten hos antikroppar mot någon parasitantigen som finns på IE-ytan, oavsett om den framkallas genom naturlig exponering eller genom vaccination. Analysen erbjuder enkel och hög genomströmning utvärdering, med god reproducerbarhet, av en viktig funktionell aspekt av antikropp-medierad immunitet i malaria. Det är därför användbart vid utvärdering av klinisk immunitet mot P. falciparum malaria, en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i tropikerna, särskilt i Afrika söder om Sahara.
Malaria är en vektorburen sjukdom som orsakas hos människor vid infektion med fem olika arter av släktet Plasmodium. Den mest förhärskande arten är P. falciparum, som också är ansvarig för den mest sjuklighet och dödlighet1. Malaria klinisk presentation varierar från asymtomatiska eller godartade infektioner till komplicerade/svår sjukdom, den senare förekommer mestadels hos barn under fem års ålder. Exponering för P. falciparum inducerar inte steril immunitet, men individer som lever i endemiska områden utvecklar långsamt immunitet mot den kliniska sjukdomen. Skydd är ålder/exponeringsberoende och immunitet förvärvas normalt under de första 5-10 åren i livet2. Vuxna kvinnor är ett viktigt undantag, som svår malaria kan uppstå under graviditeten i en klinisk presentation som kallas placenta malaria (PM). PM är en viktig orsak till abort, dödföddhet, för tidig leverans, låg födelsevikt, fosterdöd, och moderns anemi. Resistens mot PM utvecklas under på varandra följande graviditeter3. Skydd från PM är associerad med förvärv av antikroppar mot VAR2CSA-typ PfEMP14,5, en infekterad erytrocyt (IE) ytantigen som binder till kondroitinsulfat A (CSA) som möjliggör IE-kvarstad i moderkakan. Antikroppar medla skydd utför olika funktionella aktiviteter (ses överi 6,7) inklusive opsonization av IEs att inducera fagocytos. Tidiga in vitro-studier visade att antikroppar kan begränsa P. falciparumtillväxt i närvaro av monocyter via fagocytos8,9. Nyare studier har visat att högre nivåer av fagocytos-inducerande antikroppar är associerade med bättre graviditetsutfall (i samband med HIV-co-infektion)10,11, som anger relevansen av denna effektorfunktion i det naturligt förvärvade immunsvaret.
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta denna funktion av antikroppar som finns i humant plasma/serum, med hjälp av in vitro odlade IEs uttrycker VAR2CSA tillsammans med monocyte linjen THP-1. Analysen har tidigare använts11,12,13,14,15,16,17,18 och anses vara en förbättrad och enklare metod jämfört med tidigare mikroskopbaserade protokoll8, eftersom det möjliggör testning av ett större antal antikroppsprover i en enda körning med mindre volymer av antikropp och undvika tråkiga och sneda mikroskopiräkning. Även om analysen har använts av flera laboratorier och dess utförande är enkelt nog, det kräver noggrann planering och förberedelser, därför skulle ett detaljerat protokoll tillåta dess tillämpning av laboratorier och forskare saknar tidigare erfarenhet. Vi använder, som ett exempel, sent stadium-synkroniserade IEs uttrycker VAR2CSA opsonized med antikroppar som finns i serum som samlats in från kvinnor med naturligt förvärvade PM-specifika immunitet. Protokollet kan dock lätt modifieras för att analysera funktionaliteten hos antikroppar mot någon parasitantigen som finns på IE-ytan, oavsett om den framkallas genom naturlig exponering eller genom vaccination.
Protokollet som presenteras här har tidigare beskrivits ochanvänts 12,15,17,31 för att mäta kapaciteten hos antikroppar som riktar sig mot ytan av P. falciparum IEs att inducera opsonization och fagocytos av THP-1 celler. De resultat som presenteras här fokusera på naturligt förvärvade VAR2CSA-specifika antikroppar i plasma/serum av kvinnor som lever i en P. falciparum…
The authors have nothing to disclose.
Maiken Visti tackas för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete finansierades delvis genom ett bidrag (MAVARECA II; 17-02-KU) från Danmarks utrikesdepartement och administrerades av Danida Fellowship Centre. Finansiären hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller utarbetande av manuskriptet.
96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
DPBS | Sigma | P8622 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |