Differentiering af monocytter til fænocypisk forskellige makrofager efter behandling med human navlestrengsblod stamceller (CB-SC)-Afledte Exosomer
Summary
Exosome ansøgning er et nyt værktøj til udvikling af lægemidler og regenerativ medicin. Vi etablerer en exosome isolation protokol med høj renhed til at isolere exosomer fra nye identificerede stamceller kaldet CB-SC for mekanistiske undersøgelser. Vi har også coculture CB-SC-afledte exosomer med menneskelige monocytter, hvilket fører til deres differentiering i fænocypisk forskellige makrofager.
Abstract
Stamcellepædagog (SCE) terapi er en ny klinisk tilgang til behandling af type 1 diabetes og andre autoimmune sygdomme. SCE terapi cirkulerer den isolerede patientens blod mononuclear celler (f.eks lymfocytter og monocytter) gennem en aferese maskine, co-kulturer patientens blod mononukleare celler med klæbende navlestrengsblod-afledte stamceller (CB-SC) i SCE-enheden, og derefter returnerer disse “uddannede” immunceller til patientens blod. Exosomer er nano-størrelse ekstracellulære vesikler mellem 30 \u2012150 nm eksisterende i alle biofluid og cellekultur medier. For yderligere at udforske molekylære mekanismer, der ligger til grund for SCE-behandling og bestemme handlinger exosomer frigivet fra CB-SC, undersøger vi, hvilke celler der er omfattende disse exosomer under behandlingen med CB-SC. Ved at co-culturing Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer med menneskelige perifere blod mononukleare celler (PBMC), fandt vi, at CB-SC-afledte exosomer overvejende blev taget op af menneskelige CD14-positive monocytter, hvilket fører til differentiering af monocytter i type 2 makrofager (M2), med spindel-lignende morfologi og udtryk for M2-associerede overflademolekyliske markører. Her præsenterer vi en protokol for isolering og karakterisering af CB-SC-afledte eksosomer og protokollen for co-kultur CB-SC-afledte exosomer med menneskelige monocytter og overvågning af M2 differentiering.
Introduction
Navlestrengsblod stamceller (CB-SC) er unikke type stamceller identificeret fra humant navlestrengsblod og adskiller sig fra andre kendte typer stamceller såsom mesenkymale stamceller (MSC) og hæmatopoietiske stamceller (HSC)1. Baseret på deres unikke egenskaber af immun modulering og deres evne til stramt at holde sig til overfladen af petriskåle, vi udviklet en ny teknologi udpeget som Stem Cell Educator (SCE) terapi ikliniske forsøg 2,3. Under SCE terapi, en patients perifere blod mononukleare celler (PBMC) indsamles og cirkuleres gennem en celle separator og co-kulturperler med klæbende CB-SC in vitro. Disse “uddannede” celler (CB-SC-behandlet PBMC) returneres derefter til patientens cirkulation i et lukket kredsløb. Kliniske forsøg har allerede vist den kliniske sikkerhed og virkning af SCE-behandling til behandling af autoimmune sygdomme, herunder type 1-diabetes (T1D)2,4 ogalopeci areata (AA)5.
Exosomer er en familie af nanopartikler med diametre på 30\u2012150 nm og findes i alle biofluid og cellekultur medier6. Exosomer er beriget med mange bioaktive molekyler, herunder lipider, mRNAs, proteiner og microRNA ‘er (miRNA), og spiller en vigtig rolle i celle-til-celle kommunikation. For sent, exosomer er blevet mere attraktivt for forskere og farmaceutiske virksomheder på grund af deres terapeutiske potentialer i klinikker7,8,9. For nylig, vores mekanistiske undersøgelser viste, at CB-SC-frigivet exosomer bidrage til immunmodulering af SCE terapi10.
Her beskriver vi protokollen for at udforske mekanismen i SCE terapi rettet mod monocytter af CB-SC-frigivet exosomer. For det første blev EXosomer, der blev frigivet af CB-SC, isoleret fra CB-SC-afledte betingede medier ved hjælp af ultracentrifugeringsmetoder og valideret ved flowcytometri, western blot (WB) og dynamisk lyssprændering (DLS). For det andet, CB-SC-afledte exosomer blev mærket med en grøn fluorescerende lipofile farvestof: Dio. For det tredje var de co-kulturperler med PBMC at undersøge de positive procenter af Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer på de forskellige delpopulationer af PBMC ved flow cytometri. Denne protokol giver vejledning til at undersøge handlingen af exosomer underliggende immunmodulering af stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelse af exosomer er et nyt område for klinisk diagnose, lægemiddeludvikling og regenerativ medicin. Her præsenterer vi en detaljeret protokol om fremstilling af CB-SC-afledte eksosomer og den funktionelle undersøgelse af exosomer om differentiering af menneskelige monocytter. Den nuværende protokol viste, at funktionelle CB-SC-afledte eksosomer er isoleret ved sekventiel centrifugering og ultracentrifugering med høj renhed og udviser immunmodulering på monocytter.
Sammenlignet med…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Mr. Poddar og Mr. Ludwig for generøs finansiering støtte via Hackensack UMC Foundation. Vi sætter pris på Laura Zhao for engelsk redigering.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
Referências
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicina. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
