인간 코드 혈액 줄기 세포 (CB-SC)-유래 엑소좀으로 치료 후 페노전성 뚜렷한 대식세포로 단핵구를 분화
Summary
엑소솜 응용 프로그램은 신약 개발 및 재생 의학을위한 새로운 도구입니다. 우리는 기계학 연구를 위해 CB-SC에게 불린 새로운 확인된 줄기 세포에서 엑소좀을 격리하기 위하여 고순도와 엑소솜 격리 프로토콜을 설치합니다. 우리는 또한 인간의 단핵구와 CB-SC 유래 엑소좀을 결합하여 표현성 고유 의 대식세포로 분화합니다.
Abstract
줄기세포 교육자(SCE) 치료는 제1형 당뇨병 및 기타 자가면역 질환의 치료를 위한 새로운 임상 접근법이다. SCE 요법은 격리된 환자의 혈액 단핵세포(예를 들어, 림프구 및 단핵구)를 체온기계를 통해 순환시키고, 환자의 혈액 단핵세포를 SCE 장치에서 부착된 코드 혈액 유래 줄기세포(CB-SC)와 공동 배양한 다음, 이러한 “교육받은” 면역 세포를 환자의 혈액에 반환합니다. 엑소좀은 모든 생물유체 및 세포 배양 매체에 존재하는 30\u2012150 nm 사이의 나노 크기의 세포외 소포이다. SCE 치료의 근본적인 분자 메커니즘을 더 탐구하고 CB-SC에서 풀어 놓인 엑소좀의 행동을 결정하기 위하여, 우리는 CB-SC를 가진 처리 도중 이 엑소좀을 phagocytize 하는 세포를 조사합니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 디오 라벨CB-SC 유래 엑소좀을 공동 배양함으로써, CB-SC 유래 엑소좀이 주로 인간 CD14 양성 단세포에 의해 채택되어, 단일세포의 분화로 이어지는 것을 발견하여, 스핀들-유사 모폴로지및 M2 의 분자 표면의 발현과 함께 단일세포의 분화로 이어진다. 여기서, 우리는 CB-SC 유래 엑소좀의 격리 및 특성화와 인간의 단핵구와 CB-SC 유래 엑소좀의 공동 배양을 위한 프로토콜및 M2 분화의 모니터링을 위한 프로토콜을 제시한다.
Introduction
적혈구(CB-SC)는 인간 적인 코드 혈액으로부터 확인된 줄기 세포의 독특한 유형이며, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 조혈줄기 세포(HSC)1과같은 다른 알려진 유형의 줄기 세포와 구별된다. 면역 변조의 독특한 특성과 페트리 접시의 표면에 단단히 부착 할 수있는 능력에 기초하여, 우리는 임상 시험2,3에서줄기 세포 교육자 (SCE) 치료로 지정된 새로운 기술을 개발했다. SCE 치료 중 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 세포 분리기를 통해 수집 및 순환되고 체외에서 부착된 CB-SC와 공동 배양됩니다. 이러한 “교육된” 세포(CB-SC 처리 PBMC)는 닫힌 루프 시스템에서 환자의 순환으로 반환됩니다. 임상시험은 이미 제1형 당뇨병(T1D)2,4 및탈모증 아레아타(AA)5를포함한 자가면역 질환의 치료를 위한 SCE 치료의 임상 안전성 및 효능을 입증하였다.
엑소좀은 직경 이 30\u2012150 nm에 이르는 나노입자의 가족이며 모든 생물유체 및 세포 배양 배지6에존재한다. 엑소좀은 지질, mRNA, 단백질 및 microRNA(miRNA)를 포함한 많은 생리활성 분자로 풍부하며 세포 간 통신에서 중요한 역할을 합니다. 늦게, 엑소좀은클리닉7,8,9에서그들의 치료 잠재력 때문에 연구원과 제약 회사에 대한 더 매력적되고있다. 최근, 우리의 기계론 연구는 CB-SC 방출 엑소좀SCE 치료의 면역 변조에 기여한다는 것을입증10.
여기서, 우리는 CB-SC 방출 엑소좀에 의하여 단핵구를 표적으로 하는 SCE 치료의 기계장치를 탐구하기 위하여 프로토콜을 기술합니다. 첫째, CB-SC 방출 엑소솜은 초원심분리 방법을 사용하여 CB-SC 유래 컨디셔닝 된 미디어로부터 격리되고 유동 세포측정법, 서부 블롯 (WB) 및 동적 광 산란 (DLS)에 의해 검증되었습니다. 둘째, CB-SC 유래 엑소좀은 녹색 형광성 리포필리오닉 염료인 디오로 표지되었다. 셋째, PBMC와 공동 배양하여 유동 세포측정에 의한 PBMC의 다양한 하위 집단에서 디오 라벨 CB-SC 유래 엑소좀의 양수를 검사했습니다. 이 프로토콜은 줄기 세포의 면역 변조의 기초가 되는 엑소좀의 작용을 연구하기 위한 지침을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
엑소좀의 응용 은 임상 진단, 약물 개발 및 재생 의학을위한 신흥 분야입니다. 여기서는 CB-SC 유래 엑소좀의 제조와 인간 단핵구의 분화에 대한 엑소좀의 기능적 연구에 관한 상세한 프로토콜을 제시한다. 현재 프로토콜은 기능성 CB-SC 유래 엑소좀이 순도가 높은 순도및 모노사이클에 면역 변조를 나타내는 순차적 원심분리 및 초원심분리에 의해 격리된다는 것을 입증하였다.
…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 해켄색 UMC 재단을 통해 관대 한 자금 지원을 포드 다르 씨와 루드비히 씨에게 감사드립니다. 우리는 영어 편집에 대한 로라 자오 감사합니다.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
Referências
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicina. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
