Differensiering av monocytter i fenotypisk distinkte makrofager etter behandling med human cord blod stamcelle (CB-SC)-avledede exosomer
Summary
Eksosomapplikasjon er et nytt verktøy for legemiddelutvikling og regenerativ medisin. Vi etablerer en eksosom isolasjonsprotokoll med høy renhet for å isolere eksosomer fra nye identifiserte stamceller kalt CB-SC for mekanistiske studier. Vi har også coculture CB-SC-avledede eksosomer med menneskelige monocytter, noe som fører til deres differensiering i fenotypisk distinkte makrofager.
Abstract
Stamcellepedagog (SCE) terapi er en ny klinisk tilnærming for behandling av type 1 diabetes og andre autoimmune sykdommer. SCE terapi sirkulerer den isolerte pasientens blod mononukleære celler (f.eks, lymfocytter og monocytter) gjennom en apheresis maskin, co-kulturer pasientens blod mononukleære celler med tilhenger ledningen blod-avledede stamceller (CB-SC) i SCE enheten, og deretter returnerer disse “utdannet” immunceller til pasientens blod. Eksosomer er nano-størrelse ekstracellulære vesikler mellom 30 \\ u2012150 nm eksisterende i alle biofluid og celle kultur medier. For ytterligere å utforske molekylære mekanismer underliggende SCE terapi og bestemme handlingene til eksosomer utgitt fra CB-SC, undersøker vi hvilke celler fagocytize disse eksosomer under behandlingen med CB-SC. Ved å co-culturing Dio-merket CB-SC-avledede eksosomer med humant perifert blod mononukleære celler (PBMC), fant vi at CB-SC-avledede eksosomer hovedsakelig ble tatt opp av menneskelige CD14-positive monocytter, noe som førte til differensiering av monocytter i type 2 makrofager (M2), med spindellignende morfologi og uttrykk for M2-tilhørende overflatemolekylære markører. Her presenterer vi en protokoll for isolasjon og karakterisering av CB-SC-avledede eksosomer og protokollen for co-kulturen til CB-SC-avledede eksosomer med menneskelige monocytter og overvåking av M2 differensiering.
Introduction
Cord blod stamceller (CB-SC) er unik type stamceller identifisert fra menneskelig ledning blod og skiller seg fra andre kjente typer stamceller som mesenchymal stamceller (MSC) og hematopoetiske stamceller (HSC)1. Basert på deres unike egenskaper for immunmodulering og deres evne til å holde seg tett til overflaten av Petri-retter, utviklet vi en ny teknologi utpekt som stamcellepedagog (SCE) terapi i kliniskestudier 2,3. Under SCE-behandling samles en pasients perifere mononukleære blodceller (PBMC) og sirkuleres gjennom en celleseparator og co-kultivert med tilhenger CB-SC in vitro. Disse “utdannede” cellene (CB-SC-behandlet PBMC) returneres deretter til pasientens sirkulasjon i et lukket sløyfesystem. Kliniske studier har allerede vist klinisk sikkerhet og effekt av SCE-behandling for behandling av autoimmune sykdommer, inkludert type 1 diabetes (T1D)2,4 og alopecia areata (AA)5.
Eksosomer er en familie av nanopartikler med diameter som spenner 30 \\ u2012150 nm og finnes i alle biofluid og celle kultur media6. Eksosomer er beriket med mange bioaktive molekyler, inkludert lipider, mRNAer, proteiner og microRNAs (miRNA), og spiller en viktig rolle i celle-til-celle-kommunikasjon. I det siste har eksosomer blitt mer attraktive for forskere og farmasøytiske selskaper på grunn av deres terapeutiske potensialer iklinikker 7,8,9. Nylig viste våre mekanistiske studier at CB-SC-utgitte eksosomer bidrar til immunmodulering av SCE-terapi10.
Her beskriver vi protokollen for å utforske mekanismen for SCE-terapi rettet mot monocytter av CB-SC-utgitte eksosomer. Først ble CB-SC-utgitte eksosomer isolert fra CB-SC-avledede besamlede besamlede besamlede medier ved hjelp av ultracentrifugation metoder og validert av strømningscytometri, vestlig flekk (WB) og dynamisk lyssprying (DLS). For det andre ble CB-SC-avledede eksosomer merket med et grønt fluorescerende lipofilt fargestoff: Dio. For det tredje ble de co-kultivert med PBMC for å undersøke de positive prosentandelene av Dio-merkede CB-SC-avledede eksosomer ved de forskjellige underpopulasjonene av PBMC ved flytcytometri. Denne protokollen gir veiledning for å studere virkningen av eksosomer som ligger til grunn for immunmodulering av stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelse av eksosomer er et fremvoksende felt for klinisk diagnose, legemiddelutvikling og regenerativ medisin. Her presenterer vi en detaljert protokoll om utarbeidelse av CB-SC-avledede eksosomer og funksjonell studie av eksosomer om differensiering av menneskelige monocytter. Den nåværende protokollen viste at funksjonelle CB-SC-avledede eksosomer er isolert av sekvensiell sentrifugering og ultracentrifugation med høy renhet og viser immunmodulasjon på monocytter.
Sammenlignet med and…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Mr. Poddar og Mr. Ludwig for sjenerøs finansiering støtte via Hackensack UMC Foundation. Vi setter pris på Laura Zhao for engelsk redigering.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
Referências
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicina. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
