فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية
Summary
هنا هو بروتوكول فائقة الدقة التصوير بالخلايا الحية في الأنسجة سليمة. لقد قمنا بتوحيد شروط تصوير مجموعة الخلايا الجذعية البالغة الحساسة للغاية في بيئة الأنسجة الأصلية. وتنطوي هذه التقنية على تحقيق التوازن بين الاستبانة الزمنية والمكانية للسماح بالملاحظة المباشرة للظواهر البيولوجية في الأنسجة الحية.
Abstract
كانت هناك منذ فترة طويلة مقايضة حاسمة بين الدقة المكانية والزمنية في التصوير. وقد تم تقليديا التصوير خارج الحد الحيود للضوء يقتصر على استخدامها فقط على عينات ثابتة أو الخلايا الحية خارج الأنسجة المسماة مع إشارة الفلورسنت قوية. تتطلب تقنيات تصوير الخلايا الحية فائقة الدقة الحالية استخدام مسابير مضان خاصة ، أو إضاءة عالية ، أو اكتساب صور متعددة مع معالجة ما بعد الاستحواذ ، أو في كثير من الأحيان مزيج من هذه العمليات. وتحد هذه الشروط المسبقة بشكل كبير من العينات والسياقات البيولوجية التي يمكن تطبيق هذه التقنية عليها.
هنا نحن نصف طريقة لأداء فائقة الدقة (~ 140 نانومتر XY القرار) الوقت الفاصل الزمني التصوير الخلايا الحية في الموقع. هذه التقنية متوافقة أيضا مع كثافة الفلورسنت المنخفضة ، على سبيل المثال ، EGFP أو mCherry الموسومة داخليا في الجينات المعبر عنها بشكل منخفض. كدليل على المبدأ ، استخدمنا هذه الطريقة لتصور هياكل فرعية متعددة في اختبار Drosophila. أثناء إعداد الأنسجة ، يتم الحفاظ على كل من البنية الخلوية ومورفولوجيا الأنسجة داخل الخصية المشرحة. هنا ، نستخدم هذه التقنية لتصوير ديناميات microtubule ، والتفاعلات بين microtubules والغشاء النووي ، فضلا عن ارتباط microtubules إلى centromeres.
تتطلب هذه التقنية إجراءات خاصة في إعداد العينات وتركيب العينات وشل حركة العينات. بالإضافة إلى ذلك، يجب الحفاظ على العينات لعدة ساعات بعد تشريح دون المساس وظيفة الخلوية والنشاط. في حين أننا قمنا بتحسين ظروف التصوير الحي فائق الدقة على وجه التحديد في الخلايا الجذعية الجرثومية الذكور Drosophila (GSCs) والخلايا الجرثومية السلف في أنسجة الخصية تشريح، وهذه التقنية تنطبق على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة. إن القدرة على مراقبة الخلايا في ظل ظروفها الفسيولوجية دون التضحية بالدقة المكانية أو الزمنية ستكون بمثابة أداة لا تقدر بثمن للباحثين الذين يسعون إلى معالجة الأسئلة الحاسمة في بيولوجيا الخلايا.
Introduction
تصور الهياكل دون الخلوية وديناميات البروتين في الخلايا الحية مع القرار وراء حد الحيود للضوء وعادة ما يكون تحديا كبيرا1-3. في حين تم تطوير تقنيات متعددة فائقة الدقة مثل الاستشحات البصري – إعادة الإعمار – المجهر (STORM) ، والتنظير الضوئي المنشط – التعريب الدقيق (PALM) وحفز الانبعاثات – الاستنفاد (STED)4،5،6 المجهر ، والمضاعفات في إعداد العينات ، فضلا عن الحاجة إلى الحفاظ على الجدوى والنشاط في الجسم الحي ، والحد من استخدام المجهر فائقة الدقة التقليدية لتصوير العينات الحية. لا يمكن أن يصل المجهر البؤري التقليدي إلى الدقة المكانية بعد دقة XY ~ 230 نانومتر وغالبا ما يكون غير كاف لمراقبة الهياكل الفرعية الخلوية المعقدة5و6. ومع ذلك ، فإن التطور الأخير في المجهر confocal ، Airyscan فائقة الدقة التصوير ، قادرة على تحقيق ما يقرب من 140 نانومتر (XY القرار)7،8 ولديه إعداد عينة بسيطة نسبيا التي تتوافق مع التصوير الحي. منذ هذا النظام الكشف عن التصوير يتطلب وقتا طويلا اقتناء، قرارها المكانية عالية لا تأتي على حساب القرار الزمني9. لذلك، هناك حاجة إلى طريقة لضمان أن يتم توسيع التصوير بالخلايا الحية مع دقة مكانية عالية.
هنا، طورنا طريقة لمراقبة الخلايا الحية في الأنسجة السليمة بدقتها المثلى لفك الهياكل دون الخلوية مع معلومات مكانية مفصلة. تم تصميم هذه الطريقة على هذا النحو بحيث يمكن تركيب العينات بشكل ثابت لفترة طويلة من الزمن (~ 10 ساعة) دون تحريك أو تدهور. يمكن لوسائط الخلايا الحية المستخدمة في هذه التقنية دعم الوظيفة الخلوية وتجنب الbleaching الضوئي لمدة تصل إلى 10 ساعات تحت المجهر فائق الدقة. وأخيرا، يقلل هذا البروتوكول من معظم الضغوط الناجمة عن الإضاءة المستمرة لأشعة الليزر على مدى فترات طويلة من الزمن مثل نقص الأكسيجة، والتغيرات في الرطوبة ودرجة الحرارة، فضلا عن استنفاد المغذيات.
باستخدام هذا البروتوكول لتصوير Drosophila الذكور الخلايا الجذعية الجرثومية (GSCs)، كنا قادرين على ملاحظة كيف النشاط غير المتماثل من microtubules يسمح للتفاعل التفضيلي مع الكروماتيدات الشقيقة المتميزة وراثيا10،11،12،13. هذه الأنواع من الأحداث الخلوية هي ديناميكية للغاية ويصعب جدا تصور في الخلايا الحية باستخدام طرق التصوير فائقة الدقة الأخرى مثل العاصفة، بالم، أو الأمراض المنقولة جنسيا. نتوقع أن تصبح هذه الطريقة مفيدة للغاية لعلماء الأحياء الخلية لأنها تهدف إلى فهم الهياكل دون الخلوية الديناميكية للخلايا الحية الموجودة في الأنسجة. هناك العديد من المجالات التي يمكن تطبيق هذه الطريقة على, مثل دراسة ديناميات البروتينات; فهم حركة الخلايا؛ وتتبع النسب وعمليات التمايز الخلوي، من بين تطبيقات أخرى ممكنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر طرق الفحص المجهري فائقة الدقة دقة مكانية عالية يصل إلى 10s من نانومتر4،5،6. تسمح طرق الفحص المجهري STORM و PALM بدقة تصل إلى 20 إلى 50 نانومتر (دقة XY)، في حين يوفر المجهر STED دقة تتراوح بين 20 و100 نانومتر (دقة XY). الدقة المكانية للميكروسكوبي SIM يقتصر…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا مرفق التصوير المتكامل الأساسي في جامعة جونز هوبكنز على المجاهر وبرامج تحليل البيانات. نشكر ج. سنيدكر وس. إ. يو على التدقيق اللغوي والاقتراحات، وأعضاء المختبر .C العاشر على المناقشات والاقتراحات المفيدة. بدعم من NIGMS / NIH R35GM127075 ، ومعهد هوارد هيوز الطبي ، ومؤسسة ديفيد ولوسيل باكارد ، وصناديق الشركات الناشئة في جامعة جونز هوبكنز (X.C).
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
Referências
- Breedijk, R. M. P., et al. A live-cell super-resolution technique demonstrated by imaging germinosomes in wild-type bacterial spores. Scientific Reports. 10 (1), 5312 (2020).
- Maddox, P. S., et al. Imaging the mitotic spindle. Methods in Enzymology. 505, 81-103 (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): A method for super resolution fluorescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (6), 075143 (2013).
- Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nature Methods. 5 (5), 417-423 (2008).
- Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Huff, J., et al. The new 2D superresolution mode for ZEISS Airyscan. Nature Methods. 14 (12), 1223 (2017).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the potential of Airyscan microscopy for live cell imaging. Photonics. 4 (4), 41 (2017).
- Ranjan, R., Snedeker, J., Chen, X. Asymmetric centromeres differentially coordinate with mitotic machinery to ensure biased sister chromatid segregation in germline stem cells. Cell Stem Cell. 25 (5), 666-681 (2019).
- Kahney, E. W., Ranjan, R., Gleason, R. J., Chen, X. Symmetry from asymmetry or asymmetry from symmetry. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 305-318 (2017).
- Wooten, M., Ranjan, R., Chen, X. Asymmetric histone inheritance in asymmetrically dividing stem cells. Trends in Genetics. 36 (1), 30-43 (2020).
- Wooten, M., et al. Asymmetric histone inheritance via strand-specific incorporation and biased replication fork movement. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 732-743 (2019).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
