सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग ऑफ सबसेलुलर संरचनाओं
Summary
यहां प्रस्तुत अक्षुण्ण ऊतक में सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। हम अपने मूल ऊतक वातावरण में एक अत्यधिक संवेदनशील वयस्क स्टेम सेल आबादी इमेजिंग के लिए शर्तों मानकीकृत किया है । इस तकनीक में जीवित ऊतक में जैविक घटनाओं के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए लौकिक और स्थानिक संकल्प को संतुलित करना शामिल है।
Abstract
इमेजिंग में स्थानिक और लौकिक संकल्प के बीच लंबे समय से एक महत्वपूर्ण ट्रेडऑफ रहा है। प्रकाश की विवर्तन सीमा से परे इमेजिंग पारंपरिक रूप से केवल निश्चित नमूनों या मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ लेबल ऊतक के बाहर जीवित कोशिकाओं पर उपयोग करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है । वर्तमान सुपर-रिज़ॉल्यूशन लाइव सेल इमेजिंग तकनीकों के लिए विशेष फ्लोरेसेंस प्रोब्स, उच्च रोशनी, अधिग्रहण के बाद प्रसंस्करण के साथ कई छवि अधिग्रहण, या अक्सर इन प्रक्रियाओं के संयोजन के उपयोग की आवश्यकता होती है। ये आवश्यकताएं जैविक नमूनों और संदर्भों को काफी हद तक सीमित करती हैं जिन्हें इस तकनीक पर लागू किया जा सकता है।
यहां हम सीटू में सुपर-रेजोल्यूशन (~ 140 एनएम XY-रिज़ॉल्यूशन) टाइम-लैप्स फ्लोरेसेंस लाइव सेल इमेजिंग करने की विधि का वर्णन करते हैं। यह तकनीक कम फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ भी संगत है, उदाहरण के लिए, ईजीएफपी या रीचेरी को नीच व्यक्त किए गए जीन पर टैग किया गया है। सिद्धांत के सबूत के रूप में, हमने ड्रोसोफिला टेस्टिस में कई उपकोशिकीय संरचनाओं की कल्पना करने के लिए इस विधि का उपयोग किया है। ऊतक तैयारी के दौरान, सेलुलर संरचना और ऊतक आकृति विज्ञान दोनों विच्छेदित टेस्टिस के भीतर बनाए रखे जाते हैं। यहां, हम माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता, माइक्रोट्यूबुल और परमाणु झिल्ली के बीच बातचीत के साथ-साथ सेंट्रोमेरेस के लिए माइक्रोट्यूबल्स के लगाव के लिए इस तकनीक का उपयोग करते हैं।
इस तकनीक के नमूने तैयार करने, नमूना बढ़ते और नमूनों के स्थिर में विशेष प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, नमूनों को सेलुलर फ़ंक्शन और गतिविधि से समझौता किए बिना विच्छेदन के बाद कई घंटों तक बनाए रखा जाना चाहिए। जबकि हमने विशेष रूप से ड्रोसोफिला पुरुष जर्मलाइन स्टेम सेल (जीएससी) और जनक रोगाणु कोशिकाओं में विच्छेदित टेस्टिस ऊतक में लाइव सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग के लिए शर्तों को अनुकूलित किया है, यह तकनीक मोटे तौर पर विभिन्न कोशिका प्रकारों के लिए लागू होती है। या तो स्थानिक या लौकिक संकल्प त्याग के बिना अपनी शारीरिक परिस्थितियों के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करने की क्षमता सेल जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण सवालों का समाधान करने की मांग शोधकर्ताओं के लिए एक अमूल्य उपकरण के रूप में काम करेंगे ।
Introduction
प्रकाश की विवर्तन सीमा से परे संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं में उपकोशिकीय संरचनाओं और प्रोटीन गतिशीलता की कल्पना करना आमतौर पर1 -3बहुत चुनौतीपूर्ण होता है। जबकि स्टोचस्टिक-ऑप्टिकल-पुनर्निर्माण-माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), फोटो-एक्टिवेटेड-लोकलाइजेशन-माइक्रोस्कोपी (पाम) और उत्तेजित-उत्सर्जन-कमी (एसटीईटी)4,5,6 माइक्रोस्कोपी विकसित की गई हैं, नमूना तैयार करने में जटिलताओं के साथ-साथ व्यवहार्यता और गतिविधि एक्साविरो वीवो बनाए रखने की आवश्यकता, लाइव नमूनों के लिए पारंपरिक सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के उपयोग को सीमित करें। पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ~ 230 एनएम XY-संकल्प से अधिक स्थानिक संकल्प तक नहीं पहुंच सकती है और अक्सर जटिल सेलुलर उपसंरचनाओं5,6का पालन करने के लिए अपर्याप्त है। हालांकि, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, एयरस्कैन सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में हाल ही में एक विकास, लगभग 140 एनएम (XY-रिज़ॉल्यूशन)7, 8प्राप्त करने में सक्षम है औरइसमें अपेक्षाकृत सरल नमूना तैयारी है जो लाइव इमेजिंग के साथ संगत है। चूंकि इस इमेजिंग डिटेक्शन सिस्टम को लंबे अधिग्रहण के समय की आवश्यकता होती है, इसलिए इसका उच्च स्थानिक संकल्प अस्थायी संकल्प 9 की कीमत परआताहै। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है कि लाइव सेल इमेजिंग को उच्च स्थानिक संकल्प के साथ बढ़ाया जाए।
यहां, हमने विस्तृत स्थानिक जानकारी के साथ उपकोशिकीय संरचनाओं को समझने के लिए अपने इष्टतम संकल्प पर बरकरार ऊतक में जीवित कोशिकाओं को देखने के लिए एक विधि विकसित की। इस विधि को इस तरह से डिज़ाइन किया गया है ताकि नमूनों को लंबे समय तक (~ 10 एच) के लिए बिना गति या अपक्षय के स्थिर रूप से रखा जा सके। इस तकनीक में उपयोग किया जाने वाला लाइव सेल मीडिया सेलुलर फ़ंक्शन का समर्थन कर सकता है और सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप के तहत 10 घंटे तक फोटोब्लैचिंग से बच सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल हाइपोक्सिया, आर्द्रता और तापमान में परिवर्तन, साथ ही पोषक तत्वों की थकावट जैसे समय की विस्तारित अवधि में लेजर की निरंतर रोशनी के कारण होने वाले अधिकांश तनावों को कम करता है।
ड्रोसोफिला नर जर्मलाइन स्टेम सेल (जीएससी) की छवि के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम यह देखने में सक्षम थे कि माइक्रोट्यूबल्स की असममित गतिविधि एपिलीडिक रूप से अलग बहन क्रोमेटिक्स10 ,11,12,13के साथ तरजीही बातचीत के लिए कैसे अनुमति देती है। इस प्रकार की सेलुलर घटनाएं अत्यधिक गतिशील होती हैं और अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग विधियों जैसे तूफान, पाम या एसटीईटी का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं में कल्पना करना बहुत मुश्किल होता है। हम आशा करते हैं कि यह विधि कोशिका जीवविज्ञानियों के लिए अत्यधिक उपयोगी हो जाएगी क्योंकि उनका उद्देश्य ऊतकों में रहने वाली जीवित कोशिकाओं की गतिशील उपकोशिकीय संरचनाओं को समझना है। ऐसे कई क्षेत्र हैं जिनमें इस विधि को लागू किया जा सकता है, जैसे प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करना; कोशिकाओं के आंदोलन को समझना; और वंश ट्रेसिंग और सेलुलर भेदभाव प्रक्रियाओं, अन्य संभावित अनुप्रयोगों के बीच।
Protocol
Representative Results
Discussion
सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी विधियां 10 के रूप में स्थानिक संकल्प प्रदान करती हैं 10 के रूप में नैनोमीटर4,5,6। स्टॉर्म और पाम माइक्रोस्कोपी विधियां 20 से 50 एनएम (XY-रिज़ॉ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक माइक्रोस्कोप और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय में एकीकृत इमेजिंग कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम प्रूफरीडिंग और सुझावों के लिए जे स्नेडेकर और क्यू यू, और सहायक चर्चाओं और सुझावों के लिए एक्स.C लैब सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। NIGMS/NIH R35GM127075 द्वारा समर्थित, हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, डेविड और ल्यूसिले पैकार्ड फाउंडेशन, और जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड (X.C.) ।
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
Referências
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