亚细胞结构的超分辨率活细胞成像
Summary
这里介绍了一个在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的协议。我们已经标准化了在其原生组织环境中成像高度敏感的成人干细胞群的条件。该技术涉及平衡时间和空间分辨率，以便直接观察活组织中的生物现象。
Abstract
长期以来，在成像的空间和时间分辨率之间一直存在关键的权衡。传统上，超过光衍射极限的成像仅限于在标有强荧光信号的组织外的固定样品或活细胞上使用。当前的超分辨率活细胞成像技术需要使用特殊的荧光探头、高照明、多次图像采集和收购后处理，或者通常这些过程的组合。这些先决条件显著限制了该技术可以应用于的生物样本和上下文。
在这里，我们描述了一种在现场执行超分辨率（+140 nm XY 分辨率）延时荧光活细胞成像的方法。该技术还与低荧光强度相容，例如，EGFP 或 mCherry 内生标记在低表达基因。作为原理证明，我们使用这种方法可视化 德罗索菲拉 睾肠中的多个子细胞结构。在组织准备过程中，细胞结构和组织形态都保持在解剖睾膜内。在这里，我们使用这项技术来成像微管动力学，微管和核膜之间的相互作用，以及微管与中心体的附着。
该技术要求在样品准备、样品安装和标本固定方面进行特殊程序。此外，标本必须在解剖后保持数小时，同时不影响细胞功能和活动。虽然我们已经优化了活超分辨率成像的条件，特别是在 果蝇 雄性生殖干细胞（GSC）和祖细胞在解剖睾酮组织，这项技术广泛适用于各种不同的细胞类型。能够在不牺牲空间或时间分辨率的情况下观察细胞的生理条件，对于寻求解决细胞生物学关键问题的研究人员来说，将是一个宝贵的工具。
Introduction
可视化活细胞中的亚细胞结构和蛋白质动力学，其分辨率超过光的衍射极限，通常具有非常具有挑战性的1-3。虽然已经开发了多种超分辨率技术，如随机光学-光学重建-显微镜（STORM）、光激活-本地化-显微镜（PALM）和刺激-排放-消耗（STED）4、5、6显微镜，但标本制备中的并发症以及保持生存能力和活性（外视）的需要，限制了传统超分辨率显微镜对成像活体样品的使用。传统的共聚焦显微镜不能达到空间分辨率超过+230纳米XY分辨率，往往不足以观察复杂的细胞下部结构5，6。然而，最近在共聚焦显微镜，Airyscan超分辨率成像的发展，能够达到约140纳米（XY分辨率）7，8，并具有相对简单的样品制备，与实时成像兼容。由于这种成像检测系统需要较长的采集时间，其高空间分辨率确实要以时间分辨率9为代价。因此，需要一种方法来确保活细胞成像以高空间分辨率扩展。
在这里，我们开发了一种方法，以最佳分辨率观察完整组织中的活细胞，以破译具有详细空间信息的亚细胞结构。此方法的设计是这样的，以便样品可以稳定地安装很长一段时间 （+ 10 小时）， 而无需移动或退化。该技术中使用的活细胞介质可以在超分辨率显微镜下支持细胞功能，避免光出血长达 10 小时。最后，此协议将激光在长时间内持续照明（如缺氧、湿度和温度变化以及营养耗尽）造成的大多数压力降至最低。
利用这个协议来成像果蝇雄性生殖系干细胞（GSC），我们能够观察微管的不对称活性如何允许与表观遗传上不同的姐妹染色体10，11，12，13的优先相互作用。这些类型的细胞事件具有高度动态性，很难使用其他超分辨率成像方法（如风暴、PALM 或 STED）在活细胞中可视化。我们预计，这种方法将变得非常有用的细胞生物学家，因为他们的目标是了解活细胞的动态亚细胞结构，生活在组织。有许多领域可以应用这种方法，如研究蛋白质的动态：了解细胞的运动;和血统追踪和细胞分化过程，以及其他可能的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
超分辨率显微镜方法提供高达10秒的纳米4，5，6的空间分辨率。STORM 和 PALM 显微镜方法允许分辨率高达 20 到 50 nm（XY 分辨率），而 STED 显微镜的分辨率为 20 到 100 nm（XY 分辨率）。SIM显微镜的空间分辨率限制在100至130纳米15。然而，由于其高光子密度和较长的采集时间，使用这些技术进行活细胞成像极具挑战性。
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢约翰霍普金斯大学的集成成像核心设施提供显微镜和数据分析软件。我们感谢 J. 斯内德克和 Q. E. Yu 的校对和建议，以及 X .C实验室成员的有益讨论和建议。由NIGMS/NIH R35GM127075、霍华德·休斯医学研究所、大卫和露西尔·帕卡德基金会以及约翰·霍普金斯大学启动基金（X.C.）支持。
Materials
| Adobe Illustrator CS6 (figure making software) | Adobe | N/A | |
| Dialysis membrane | Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane | Cat No. 08-67121 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | Cat. no. 26140079 | 15% (V/V) |
| Fiji (analysis software) | NIH | N/A | Image fluorescence intensity quantification |
| Glass bottom cell culture dishes (FluroDish) | World Precision Instrument, Inc. | FD35PDL-100 | |
| Imaris (image reconstruction software) | Bitplane | N/A | 3D image reconstruction |
| Imerssion oil | Zeiss | Immersol 518F/30 °C | |
| Insulin | Sigma | Cat. No. 15550 | 200 µg/ml |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | Cat No. – 15140-122 | 0.6x |
| Schneider Drosophila media | Invitrogen | Cat No. – 11720-034 | |
| Spinning disc confocal microscope | Zeiss | N/A | equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA). |
| Tissue paper | Kimwipe | N/A | Wet to form humid chamber |
| LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module | Zeiss | N/A | equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA) |
| ZEN (imaging software) | Zeiss | N/A |
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