マウス心臓における毛細血管、細動脈、および周囲細胞の動的測定とイメージング
Summary
ここでは、中隔動脈がカニュール化および加圧されるように、動脈灌流圧および流れを維持する動脈灌流圧および流れのex vivoモニタリング、ならびに毛細血管床および周囲細胞を含む血管樹木成分のエキビボモニタリングによって、生きているマウス心臓組織における冠状微小循環を研究するためのプロトコルである。
Abstract
毛細血管の開閉と共に冠状動脈の緊張は、一定の灌流圧で心筋細胞への血流を主に決定する。しかし、心臓全体の冠状動脈と毛細血管の動的変化を監視することは困難である, 主にその動きとノンストップの鼓動.ここでは、マウス右心室の乳頭筋における動脈灌流速度、圧力、および動脈および毛細血管の直径変化をモニタリングできる方法について述べている。マウス中隔動脈は、一定の流れまたは圧力でカニューレ化され、他の動的に測定される。蛍光標識レクチン(例えば、アレクサ・フルオール-488または-633標識ウィート・ゲルム・グルチニン、WGA)で灌流した後、右心室の乳頭筋および中隔の動脈および毛細血管(および他の血管)を容易に画像化することができた。血管径の変化は、心臓収縮の有無において測定することができる。遺伝子組み換え蛍光タンパク質が発現した場合、特定の特徴を監視することができた。例えば、NG2-DsRedを発現したマウス心臓でペリサイトを可視化した。この方法は、心臓の毛細血管のペリサイトの生理機能を研究するための有用なプラットフォームを提供してきた。血管/毛細管径と動脈の光圧を同時に測定することで、心臓の血流に対する試薬の効果を研究するのにも適しています。この調製物は、最先端の光学画像システムと組み合わせることで、ほぼ生理学的条件下で心臓の細胞および分子レベルで血流とその制御を研究することを可能にする。
Introduction
適切な冠状動脈圧流制御は、その代謝要求を満たすために心臓に十分な血液供給を保証する 1.しかし、過去数十年間に生体内およびインビトロで行われてきた広範な研究にもかかわらず、冠状動脈圧流が心臓でどのように動的に調節されているかは、最近になってようやく明らかになりました。その理由の一つは、心臓の絶え間ない鼓動によるこのような研究のための生理学的作業モデルの確立の難しさである。いずれにせよ、生体組織や動物における冠状動脈微小血管の観察には種々の方法が確立されているが、これらの方法のいずれも、圧力、流れ及び微小血管径の測定と一定/安定的な焦点を達成できなかった2,3。心臓を鼓動する冠動脈微小血管の直接可視化は数十年前に導入されました4,3, 小血管の直径の測定は困難であり、微小循環に関連する多くの特殊な細胞タイプの特定の機能は同様に厄介でした.ストロボスコピック法と浮遊目的システムでさえ、上記の情報を同時に提供できませんでした5.それにもかかわらず、前述の技術を用いてかなりの量の貴重な情報が得られ、冠状血流の調節に関する理解を深めるのに役立っています。この論文で説明する方法は、冠状動脈、細動脈および微小血管系の成分が刺激および代謝要求に対してどのように反応するかを調査し、詳細に理解するのに役立つ。
これらの研究を追求するために確立した作業モデルは、前作のWesterhofらの2に基づいて構築された。マウス心臓の中隔動脈のカヌル化後、生理食塩水は、筋細胞および心臓組織の他の成分を栄養を保つためにその動脈を浸透させるために使用された。動脈灌流圧、流れ及び血管径は、適切な蛍光指標を用いて他の生理学的機能の中でモニターした。この方法により、生体組織の生理的圧力下で冠状動脈性微小血管床を可視化し、初めて微小循環調節の基盤となる細胞機構を研究することが可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、生理的条件下で心臓の冠状微小循環を研究する非常に単純でありながら非常に実用的なex vivo法を導入しました。この方法は、ラット2を用いた機械的調査から改変した。その他、高速かつ高い光学分解能を備えたイメージング技術が実現しました。そのため、現在市販されている高度な光学イメージングシステムを利用することができました。機能する乳頭筋?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、バイオメディカル工学技術センター(BioMET)によって部分的にサポートされました。NIH(1U01HL116321)および(1R01HL142290)および米国心臓協会10SDG4030042(GZ)、19POST34450156(HCJ)。
Materials
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
Referências
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
