माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी एडहजारडिया एडीआईएस कोसंस्कृति देने के लिए एक प्रोटोकॉल। परजीवी एडीज एजिप्टी मच्छरों की एक पीढ़ी से लार्वा चरण में क्षैतिज हस्तांतरण के माध्यम से अगले तक ले जाया जाता है जिसके बाद वयस्क चरण में ऊर्ध्वाधर संचरण होता है। संक्रमित अंडों में लाइव स्पोरोप्लास्म लंबे समय तक जीवित रहते हैं।
एडहजारिया एडीआईएस एडीज एजिप्टी मच्छरों का एक माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी है, जो एक रोग वेक्टर है जो कई आर्बोवायरस को प्रसारित करता है जो हर साल लाखों रोग के मामलों का कारण बनता है। ई. एडीआईएस मच्छर वेक्टर में मृत्यु दर और कम प्रजनन फिटनेस का कारण बनता है और बायोकंट्रोल एजेंट के रूप में इसकी क्षमता के लिए पता लगाया गया है। ई. एडीआईएस को बनाने के लिए हम जो प्रोटोकॉल पेश करते हैं, वह इसके प्राकृतिक संक्रमण चक्र पर आधारित है, जिसमें मच्छर मेजबान के विभिन्न जीवन चरणों में क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर संचरण दोनों शामिल हैं। एई. एजिप्टी मच्छर लार्वा चरण में बीजाणुओं के संपर्क में आते हैं। ये संक्रमित लार्वा तो वयस्कों में परिपक्व होते हैं और परजीवी को अपनी संतानों को खड़ी रूप से संचारित करते हैं। संक्रमित संतानों को भविष्य के क्षैतिज संचरण के लिए बीजाणुओं के स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है। संस्कृति ई. एडीआईएस परजीवी के जीवन चक्र की जटिलताओं को देखते हुए अदीक्षित के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और यह प्रोटोकॉल स्पष्टीकरण के लिए विस्तृत मार्गदर्शन और दृश्य एड्स प्रदान करता है।
एडीज एजिप्टी कई आर्बोवायरस (जैसे, डेंगू, ज़िका, येलो फीवर) का मच्छर वेक्टर है जो हर साल सैकड़ों लाखों रोग के मामलों के लिए खाते का अनुमान है और 30,000 से अधिक मौतें1,2। इन रोगजनकों के कारण होने वाली बीमारियों का उपचार सहायक देखभाल तक सीमित है और यह संभावना है कि भविष्य में अतिरिक्त आर्बोवायरस उभरकरसामनेआएंगे । मच्छर वेक्टर का नियंत्रण प्राथमिक महत्व का है, क्योंकि यह प्रभावी रूप से वर्तमान और उभरते रोगजनकों के संचरण को रोकता है4। परंपरागत रूप से, वेक्टर नियंत्रण रणनीतियां मुख्य रूप से रासायनिक कीटनाशकों का उपयोग करती हैं, लेकिन कई आमतौर पर उपयोग की जाने वाली कीटनाशकों के प्रतिरोध ने वेक्टर नियंत्रण के उपन्यास तरीकों की मांग को प्रेरित किया है। एई. एजिप्टी के खिलाफ अपने जैव नियंत्रण गुणों के लिए खोजे गए एक संभावित एजेंट परजीवी एडहजारडिया एडीआईएस5,6है।
ई. एडीआईएस,जो पहली बार 1 9 30 में कूडो द्वारा नोसेमा एडीआईएस के रूप में पहचाना जाता है, एई. एजिप्टी मच्छरों का एक माइक्रोस्पोरिडियन परजीवीहै। ईई एडीज का विकास और प्रजनन अपेक्षाकृत जटिल है और इसका जीवन चक्र कई तरीकों से आगे बढ़ सकता है7,8,9. एक सामान्य विकास चक्र का वर्णन बेकनेल एट अल, 19897 में गहराई से किया गया है और इसका उपयोग प्रयोगशाला प्रचार(चित्र 1) 8के लिए कियाजाताहै। संक्षेप में, चक्र तब शुरू होता है जब एई. एजिप्टी अंडे खड़ी ई. एडीआईएस से संक्रमित लार्वा में निकलते हैं जो वसा शरीर में यूनिन्यूलेट बीजाणु विकसित करते हैं, और आमतौर पर लार्वा या प्यूप के रूप में मर जाते हैं। मृत लार्वा से छोड़े गए यूनिन्यूलेट बीजाणु आवास को दूषित करते हैं और स्वस्थ एई. एजिप्टी लार्वा द्वारा निगला जाता है। ये बीजाणु मुख्य रूप से पाचन तंत्र में अंकुरित होते हैं, जो उजागर लार्वा के पाचन ऊतक को संक्रमित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्षैतिज संचरण होता है। क्षैतिज रूप से संक्रमित लार्वा वयस्कों (माता-पिता की पीढ़ी) में विकसित होते हैं जहां द्वि नाभिक बीजाणु बनते हैं। मादा में, ये द्विन्यूक्लिट बीजाणु प्रजनन पथ पर आक्रमण करते हैं और उनके संबंधित स्पोरोप्लाज्म अंडे की कोशिकाओं को विकसित करने को संक्रमित करते हैं। ये अंडे तब संक्रमित लार्वा (फिलियल पीढ़ी) में निकलते हैं, जिसके परिणामस्वरूप परजीवी का ऊर्ध्वाधर संचरण और ऊपर वर्णित चक्र की निरंतरता होती है।
कई अध्ययनों ने बायोकंट्रोल के लिए ई एडिस की क्षमता की जांच की है। ई. एडीआईएस के साथ संक्रमण का प्रदर्शन किया गया है जिसके परिणामस्वरूप एई. एजिप्टी महिलाओंकी प्रजनन क्षमता कम हो गई है । इसके अलावा, एक अर्ध-क्षेत्र प्रयोग में, ई. एडीआईएस की जलसंखात्मक रिहाई के परिणामस्वरूप एक परीक्षणएई का कुल उन्मूलन हुआ। मच्छरों की प्रजातियों के विविध सेट में विकास के कुछ चरणों से गुजरने में सक्षम होने के दौरान, ई. एडीज केवल एई. एजिप्टीमें ऊर्ध्वाधर रूप से फैलता है, जो उच्च स्तर की मेजबान विशिष्टता11,12का संकेत देता है। इसी तरह, ई. एडीआईएससे जुड़े संभावित पर्यावरणीय जोखिम के प्रयोगशाला आकलन में, माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी गैर-लक्षित जलीय जीवों को संक्रमित करने में विफल रहा, जिसमें शिकारियों ने ई. एडीआईएस13से संक्रमित एई. एजिप्टी लार्वा को निगला। ये परिणाम प्राकृतिक एई. एजिप्टी आबादी को लक्षित करने वाली जैविक नियंत्रण रणनीतियों में उपयोग किए जाने वाले ई. एडीआईएस की क्षमता को उजागर करते हैं।
इस तथ्य के बावजूद कि ई. एडीआईएस वेक्टर नियंत्रण में उपयोग के लिए वादा दिखाता है, इसे व्यापक पैमाने पर बनाने और तैनात करने के लिए चुनौतियां हैं। ई. एडीस बीजाणु ठंडे तापमान (यानी, 5 डिग्री सेल्सियस) पर एक दिन से भी कम समय में संक्रमितता खो देते हैं। यहां तक कि गर्म तापमान (यानी, 25 डिग्री सेल्सियस) पर, बीजाणु तेजी से तीन सप्ताह14के दौरान संक्रमितता खो देते हैं । इसके अतिरिक्त, ई. एडीज को लाइव एई में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। एजिप्टी मच्छरों और स्वस्थ लार्वा मच्छरों की नियंत्रित डोजिंग जीवन चक्र को पूरा करने और संस्कृति 8 के लिए उपयोग की जाने वालीआबादीके पतन को रोकने के लिए आवश्यक है। वीवो संस्कृति में की आवश्यकता एक चुनौती प्रस्तुत करता है; हालांकि, मच्छर मास पालन और रोबोटिक्स (जैसे, मासारो एट अल15)में हाल की प्रगति ई. एडीस बीजाणुओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अनुमति दे सकती है। हम आशा करते हैं कि इस पद्धति के दृश्य से ई. एडीआईएस पालन प्रोटोकॉल तक पहुंच बढ़ेगी और अधिक शोधकर्ताओं को इस प्रणाली की बुनियादी जीव विज्ञान और लागू क्षमता की जांच करने की अनुमति मिलेगी। हम यह भी आशा करते हैं कि यह इंजीनियरों, रोबोटिक्स और व्यापक प्रौद्योगिकी क्षेत्र के साथ सहयोग बढ़ाने की सुविधा प्रदान करेगा, जो ई. एडीआईएसके बड़े पैमाने पर पालन में सुधार करने का काम कर सकता है ।
चित्रा 1: ई. एडीज प्रचार एई. एजिप्टीमें । ई. एडीआईएस का प्रचार ई एडिस संक्रमित अंडों से हैचिंग के साथ शुरू होता है। संक्रमित लार्वा को 4 वें इंस्टार मेंपाला जाता है, ई. एडीस बीजाणु उन लार्वा सेअलग होते हैं, और बीजाणुओं का उपयोग अंडे के असंक्रमित क्लच (क्षैतिज संचरण) से पाला जाता है। इन मौखिक रूप से संक्रमित लार्वा को तब वयस्कता (माता-पिता की पीढ़ी) में पाला जाता है और ई. एडीआईएस (ऊर्ध्वाधर संचरण) से संक्रमित अंडे डालते हैं। संक्रमित अंडे (संतानीय पीढ़ी) तो संक्रमण चक्र और परजीवी संस्कृति जारी रखने के लिए रची जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
हम यहां मूल रूप से हेम्ब्री और रयान, १९८२८ में ई. एडीज माइक्रोस्पोराइडिया को पालने के लिए वर्णित विधि पेश करते हैं। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले ई एडिस का तनाव 197919में थाईलैंड में स्टीफन हेम्ब्रे द्वारा मूल क्षेत्र संग्रह से लिया गया था। यह विधि क्षैतिज संचरण पर कैपिटल होती है, जो स्वाभाविक रूप से ई. एडीआईएस7 के संचरण चक्र में होतीहै, परजीवी कोनियंत्रिततरीके से प्रचारित करने के लिए। यह विधि उन नए चेहरे के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है जो बीजाणु उपस्थिति, लार्वा में संक्रमण के लक्षणों, या बहु-चरण पालन/डोजिंग प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए आवश्यक समन्वय से परिचित नहीं हैं। हमारी आशा है कि दृश्य एड्स है कि इस प्रोटोकॉल के साथ शोधकर्ताओं जो संस्कृति ई. aedis की इच्छा के लिए प्रवेश करने के लिए बाधाओं को कम करेगा ।
हमने एई. एजिप्टी में ई. एडीजिप्टी को ऊपर वर्णित किया है और फिलियल पीढ़ी में परजीवीवाद की सफलता की मात्रा निर्धारित की है। संक्षेप में, हमने ई. एडीस संक्रमित एई. एजिप्टी अंडे को रचा, उन्हें 4वें इंस्टार में पाला, और संक्रमित लार्वा से यूनिन्यूलेट ई. एडीआईएस बीजाणु एकत्र किए। हम तो क्षैतिज मौखिक घूस के माध्यम से इन बीजाणुओं के साथ स्वस्थ लार्वा संक्रमित है, और वयस्कता के लिए क्षैतिज संक्रमित लार्वा पाला । हमने संक्रमित वयस्कों (माता-पिता की पीढ़ी) और एकत्र अंडे (संतानीय पीढ़ी) को रक्त खिलाया, जिसे हमने परिकल्पना की थी कि ई. एडीस परजीवी से ऊर्ध्वाधर रूप से संक्रमित होगा। हमने फिलियल पीढ़ी से अंडे लिए और लार्वा के एक सबसेट को एकत्र और समरूप किया जब वे 4वें स्टार थे। हमने ई. एडीआईएस से संक्रमित लार्वा के प्रतिशत और सभी संक्रमित व्यक्तियों में कुल बीजाणु गिनती की मात्रा निर्धारित की। हमने पाया कि विशाल बहुमत (96%) व्यक्तियों के संक्रमित थे और संक्रमित लार्वा का मतलब बीजाणु लोड ~ 105था . हम निष्कर्ष निकालते हैं कि हमारे पालन प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एई. एजिप्टी मच्छरों में ई. एडीज का अत्यधिक सफल प्रचार हुआ ।
इस प्रोटोकॉल के कई पहलू हैं जो अदीक्षित उपयोगकर्ता के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। हम कुछ अतिरिक्त जानकारी है कि सहायता की हो सकती है नीचे की पेशकश करते हैं । सामान्य मच्छर पालन के बारे में सवालों के लिए, एई. एजिप्टी कॉलोनी रखरखाव के लिए एक पूर्ण गाइड इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है। हालांकि, कई सामान्य सवालों को बायोडिफेंस और उभरते संक्रमण अनुसंधान संसाधन भंडार16,17 से संसाधनों द्वारा संबोधित किया जा सकता है जिसमें अंडा हैचिंग, सामान्य आहार की जरूरत, आवास और पर्यावरणीय स्थितियां, और रक्त आहार शामिल हैं। संक्रमण की समयरेखा के बारे में, संक्रमित अंडों से रची गई लार्वा 4th इंस्टार चरण में देर तक संक्रमण के लक्षण नहीं दिखाती है। 1-2 दिनों के दौरान, यूनिन्यूलेट बीजाणु तेजी से दिखाई देते हैं। लार्वा 6 दिनों के बाद से हैचिंग पर लगभग असंक्रमित दिखाई दे सकता है लेकिन 7 या 8 के बाद के दिन से अत्यधिक संक्रमित हो सकता है। इसके अतिरिक्त, समरूप नमूनों में बीजाणुओं की कल्पना करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि पूरे मच्छर समरूप में कई अन्य रोगाणु मौजूद हैं, जिनमें ई. एडीआईएस यूनिन्यूलेट बीजाणुओं के समान आकार के अन्य यूकेरियोटिक एकल-कोशिकीय जीव (जैसे, खमीर) शामिल हैं। ई. एडीआईएस बीजाणु(चित्रा 2 ए)का विशिष्ट आकार पहचान के लिए एक अत्यधिक विश्वसनीय तरीका है और समरूप में अन्य रोगाणुओं से ई. एडीआईएस को अलग करने में मदद करेगा। हालांकि यह पहचान या मात्राकरण के लिए आवश्यक नहीं है, यदि बीजाणु शुद्धिकरण वांछित है, तो इसे कोलॉयडल सिलिका घनत्व ग्रेडिएंट अपकेंद्रित्र के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है जो समरूप में अन्य दूषित तत्वों से ई एडिस बीजाणुओं को अलग करने की अनुमति देगा। इस प्रक्रिया को सोल्टर एट अल20में विस्तार से वर्णित किया गया है।
पालन प्रथाओं में उपयोग किए जाने वाले तापमान और आहार आमतौर पर प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न होते हैं, लेकिन विविधताओं से अभी भी सफल परजीवी प्रचार की संभावना होगी। लार्वा खाद्य प्रकार में मामूली अंतर सफल संक्रमण में हस्तक्षेप नहीं करते हैं, हालांकि हमने इस प्रोटोकॉल में विभिन्न खाद्य प्रकारों का स्पष्ट रूप से परीक्षण नहीं किया। संक्रमण पर तापमान के प्रभाव का परीक्षण किया गया है और ई. एडीस संक्रमण21के तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला पर मजबूत पाया गया था । अधिकतम बीजाणु उत्पादन 30.8 डिग्री सेल्सियस पर हुआ, लेकिन अभी भी 20 डिग्री सेल्सियस के रूप में कम तापमान पालन में मजबूत था । बीजाणु गिनती नाटकीय रूप से उच्च पालन तापमान (36 डिग्री सेल्सियस) पर कम हो गई थी, इसलिए इस प्रोटोकॉल के लिए इन तापमान से बचा जाना चाहिए।
परजीवी के साथ काम करते समय प्रदूषण हमेशा एक चिंता का विषय होता है। ई. एडीआईएस एई. एजिप्टी का एक सफल परजीवी है और इसलिए संदूषण को रोकने के लिए असंक्रमित प्रयोगशाला उपनिवेशों से अलग रखा जाना चाहिए। हम यदि संभव हो तो संक्रमित मच्छरों को एक अलग इनक्यूबेटर में भंडारण की सलाह देते हैं। हमने यह भी सिफारिश की है कि माइक्रोस्पोराइडिया कार्य (जैसे, लार्वा ट्रे, स्थानांतरण पिपेट, पिंजरे, अंडा संग्रह कप) के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री माइक्रोस्पोराइडिया काम के लिए नामित की जाती है और पूरे कीटनाशक में अधिक मोटे तौर पर उपयोग नहीं की जाती है। उपयोग के बाद 10% ब्लीच के साथ सभी पालन सामग्रियों को निष्फल किया जाना चाहिए और ब्लीच नसबंदी के पूरक के लिए ऑटोक्लेविंग का उपयोग किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम मच्छर पालने के साथ मदद के लिए स्पेंसर ब्लैंकशिप का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम पांडुलिपि पर उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए जेम्स एन राडल और एम डोमिनिक मैजिस्ट्राडो को भी धन्यवाद देते हैं।
120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
Autoclave | For sterilization | ||
Bleach | For sterilization | ||
Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
Pipette 1 – 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
Pipette 100 – 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
Pipette tips 1 – 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
Pipette tips 100 – 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |