SEC-BioSAXS målinger av biologiske makromolekyler er en standard tilnærming for å bestemme løsningsstruktur av makromolekyler og deres komplekser. Her analyserer vi SEC-BioSAXS-data fra to typer vanlige SEC-spor – kromatatogrammer med fullstendig løste og delvis løste topper. Vi demonstrerer analysen og dekonivolution ved hjelp av scatter og BioXTAS RAW.
BioSAXS er en populær teknikk som brukes i molekylær og strukturell biologi for å bestemme løsningsstrukturen, partikkelstørrelse og form, overflate-til-volum-forhold og konformasjonsendringer av makromolekyler og makromolekylære komplekser. Et SAXS-datasett av høy kvalitet for strukturell modellering må være fra monodisperse, homogene prøver, og dette nås ofte bare ved en kombinasjon av innebygd kromatografi og umiddelbar SAXS-måling. Oftest brukes størrelsesekskludering kromatografi til å skille prøver og utelukke forurensninger og aggregasjoner fra interessepartikkelen slik at SAXS-målinger kan gjøres fra en godt løst kromatografisk topp av en enkelt proteinart. Likevel, i noen tilfeller, selv inline rensing er ikke en garanti for monodisperse prøver, enten fordi flere komponenter er for nær hverandre i størrelse eller endringer i form indusert gjennom binding endre oppfattet elution tid. I slike tilfeller kan det være mulig å dekonvolutere SAXS-dataene til en blanding for å oppnå de idealiserte SAXS-kurvene til individuelle komponenter. Her viser vi hvordan dette oppnås, og den praktiske analysen av SEC-SAXS-data utføres på ideelle og vanskelige prøver. Spesielt viser vi SEC-SAXS-analysen av vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.
Biologiske makromolekyler er for små til å bli sett selv med de beste lette mikroskopene. Nåværende metoder for å bestemme sine strukturer innebærer vanligvis krystallisering av proteinet eller målinger på et stort antall identiske molekyler samtidig. Mens krystallografi gir informasjon om atomnivået, representerer det et kunstig prøvemiljø, gitt at de fleste makromolekyler ikke presenteres i krystallinsk form i cellen. I løpet av de siste par årene har kryoelektronmikroskopi levert lignende høyoppløselige strukturer av store makromolekyler / makromolekylære komplekser, men selv om prøvene er nærmere fysiologisk tilstand, er de fortsatt frosset, derav immobile og statiske. Bio-liten vinkel Røntgensplitting (BioSAXS) gir en strukturell måling av makromolekylet, under forhold som er relevante for biologi. Denne tilstanden kan visualiseres som en lav oppløsning 3D-form bestemt på nanometer skala og fanger hele konformasjonsområdet til makromolekylet i løsningen. BioSAXS eksperimenter effektivt vurdere oligomerisk tilstand, domene og komplekse ordninger samt fleksibilitet mellom domener1,2,3. Metoden er nøyaktig, for det meste ikke-destruktiv og krever vanligvis bare et minimum av prøveforberedelse og tid. Men for den beste tolkningen av dataene må prøvene være monodispere. Dette er utfordrende; biologiske molekyler er ofte utsatt for forurensninger, dårlig rensing og aggregering, for eksempel fra fryse tining4. Utviklingen av inline kromatografi etterfulgt av umiddelbar SAXS-måling bidrar til å redusere disse effektene. Størrelse-ekskludering kromatografi skiller prøvene etter størrelse dermed unntatt de fleste forurensninger og aggregasjoner5,6,7,8,9,10. Men i noen tilfeller er selv SEC-SAXS ikke tilstrekkelig til å produsere en monodisperse prøve, fordi blandingen kan bestå av komponenter som er for nær i størrelse eller deres fysiske egenskaper eller deres raske dynamikk fører til overlappende topper i SEC UV-spor. I slike tilfeller kan et programvarebasert overføringstrinn for de oppnådde SAXS-dataene føre til en idealisert SAXS-kurve for den enkeltekomponenten 5,11,12. Som et eksempel, i protokollseksjon 2, viser vi standard SEC-SAXS-analyse av vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant (E9 exominus) i kompleks med DNA. Vaccinia representerer modellorganismen til Poxviridae, en familie som inneholder flere patogener, for eksempel det menneskelige koppeviruset. Polymerasen ble vist å binde seg tett til DNA i biokjemiske tilnærminger, med strukturen av komplekset nylig løst av røntgenkrystallografi13.
De fleste synchrotron-anlegg vil gi en automatisert databehandlingsrørledning som vil utføre data normalisering og integrering som produserer et sett med ikke-prosenterte rammer. Men tilnærmingen beskrevet i dette manuskriptet kan også brukes med en laboratoriekilde forutsatt at SEC-SAXS utføres. Videre kan ytterligere automatisering være tilgjengelig som vil avvise strålingsskadede rammer og utføre bufferundertraksjon14. Vi vil vise hvordan du utfører primærdataanalyse på forhåndsbearbeidede data og får mest mulig ut av de tilgjengelige dataene i avsnitt 2.
I avsnitt 3 viser vi hvordan vi dekonvoluterer SEC-SAXS-data og analyserer kurvene effektivt. Mens det finnes flere deconvolution metoder som Gaussian peak deconvolution, implementert i USA-SOMO15 og Guinier optimalisert maksimal sannsynlighet metode, implementert i DELA programvare16, disse vanligvis krever en modell for toppform12. Den begrensede størrelsen på individuelle topper vi undersøker tillater bruk av utviklende faktoranalyse (EFA), som en forbedret form for entall verdinedbrytning (SVD) for å dekonvolutere overlappende topper, uten å stole på toppformen eller spredningsprofilen5,11. En SAXS-spesifikk implementering finnes i BioXTAS RAW17. EFA ble først brukt på kromatografidata da 2D-diodematrisedata tillot matriser å bli dannet fra absorbans mot oppbevaringstid og bølgelengdedata18. Der EFA utmerker seg er at den fokuserer på den utviklende karakteren av entallsverdier, hvordan de endres med utseendet på nye komponenter, med forbeholdet om at det er en iboende rekkefølge i oppkjøpet10. Heldigvis gir SEC-SAXS-data alle nødvendige bestilte innhentingsdata i organiserte 2D-dataarrayer, og låner seg pent til EFA-teknikken.
I avsnitt 4 vil vi demonstrere det grunnleggende om modelluavhengig SAXS-analyse fra bufferbakgrunnen trukket SAXS-kurven. Modelluavhengig analyse bestemmer partikkelens radius-of-gyration (Rg), volum-of-correlation (Vc), Porod Volume (Vp) og Porod-Debye Exponent (PE). Analysen gir en semi-kvantitativ vurdering av partikkelens termodynamiske tilstand når det gjelder kompakthet eller fleksibilitet via den dimensjonsløse Kratky-tomten2,4,19.
Til slutt måles SAXS-data i gjensidige plassenheter, og vi vil vise hvordan du forvandler SAXS-dataene til det virkelige rommet for å gjenopprette pardistansen, P(r), distribusjonsfunksjonen. P(r)-fordelingen er settet av alle avstander som finnes i partikkelen og inkluderer partikkelens maksimale dimensjon, dmaks. Siden dette er en termodynamisk måling, representerer P(r)-fordelingen det fysiske rommet som brukes av partiklenes konformasjonsrom. Riktig analyse av et SAXS-datasett kan gi løsningsstatistikk innsikt som utfyller høyoppløselig informasjon fra krystallografi og cryo-EM.
Det er ønsket å ha en monodisperse prøve før du starter et SAXS-eksperiment, men i virkeligheten tilfredsstiller mange datasamlinger ikke dette og må forbedres ved å kombinere målingen med innebygd kromatografi – SEC i de fleste tilfeller. Men selv mangelen på tid mellom rensing og datainnsamling monodispersity av prøven er ikke garantert. Vanligvis gjelder dette eksperimenter der komponenter er for nær i størrelse eller i deres fysiske egenskaper som skal skilles eller er utsatt for rask dynamikk. Her har vi gitt en protokoll som kombinerer enkeltverdi nedbrytning med utviklende faktoranalyse for å fjerne påvirkningen av DNAbound E9 exominus fra sin ubundet form og skape en monodisperse spredningsprofil som vi da kunne analysere med SAXS-pakken Scatter IV.
SVD med EFA av SEC-SAXS-data er svært kraftige metoder utviklet for å dekonvolutere SAXS-data og forbedre analysen, men de har begrensninger. De krever at støy eller drift i bufferen baseline av SEC-SAXS holdes på et minimum. Dette kan innebære ekstra kolonnelikevekt (bedre å bruke mer enn 3 kolonnevolumer, avhengig av bufferen) før eksempelinnlasting. Det mest kritiske trinnet er imidlertid valget av antall entallsverdier og dataområdet som brukes, da dette i stor grad vil påvirke nøyaktigheten av overføringen. Det er av denne grunn at resultatene ikke bør tas på egen hånd, men videre analysert ved hjelp av teknikker som analytisk ultracentrifugation (AUC) eller multi-vinkel-laser-lys-spredning (MALLS) for biologisk tolkning.
Scatter IV er en ny programvarepakke, gratis for forskning og industriell bruk med et intuitivt brukergrensesnitt som gjør det mulig for selv ikke-eksperter å analysere dataene sine. Scatter IV har flere nye funksjoner som bidrar til å forbedre analysen av SEC-SAXS-data, for eksempel varmekartet knyttet til signalplottet, noe som muliggjør større nøyaktighet med valg av bildevalg. I primær dataanalyse tilbyr Guinier Peak-analysen og kryssvalideringsplottet knyttet til P(r)-analysen en integrert feilsøkingsevne i programvaren.
Det bør nevnes at mange andre programmer kan brukes til primær dataanalyse; disse inneholder de samme grunnleggende funksjonene og oppdateres også regelmessig, for eksempel BioXTAS RAW17 ATSAS-pakke24 og US-SOMO15 for å nevne noen.
Men uansett hvilken SAXS-pakke som brukes til analyse, er de viktigste begrensningene vanlige: prøveforberedelsen, før innsamling og analyse. I E9 exominus eksempel vist, er det klart å se forbedringen i signal til støy forholdet og med en reduksjon i Rg dmax forbundet med en monodisperse prøve. Dette vil i stor grad bidra til videre behandling av data som montering eller modellering med kjente høyoppløselige strukturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner den økonomiske støtten til prosjektet fra det franske tilskuddet REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 og av forskningsstipender fra Service de Santé des Armées og Délégation Générale pour l’Armement. Vi er takknemlige til ESRF for SAXS-stråletiden. Dette arbeidet brukte plattformene til Grenoble Instruct-ERIC center (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) i Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), støttet av FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) og GRAL, finansiert i University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS anerkjenner integrering i Det tverrfaglige forskningsinstituttet i Grenoble (IRIG, CEA). Vi takker Wim P. Burmeister og Frédéric Iseni for økonomisk og vitenskapelig støtte, og vi takker også Dr. Jesse Hopkins fra BioCAT ved APS for hans hjelp og for å utvikle BioXTAS RAW.
Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
BioXTAS Raw 1.2.3. | MacCHESS | http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html | First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins |
HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
Scatter | Diamond Light Source Ltd | http://www.bioisis.net/tutorial/9 | Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany) |
Superdex 200 Increase 5/150 GL column | GE Healthcare | 28990945 | SEC-SAXS column used |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B |