Quantificação do DNA específico do porco circulante no sangue de um modelo de xenotransplante

Resumo

Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas. Utilizando primers específicos de espécies, o CPSDNA foi quantificado por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco.

Resumo

Xenotransplante é um método viável para tratar a falência de órgãos. No entanto, como monitorar efetivamente a rejeição imune do xenotransplante é um problema para médicos e pesquisadores. Este manuscrito descreve um método simples e eficaz para monitorar a rejeição imunológica em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco. O DNA circulante é um biomarcador potencialmente não invasivo para danos nos órgãos. Neste estudo, o DNA específico do suíno circulante (cpsDNA) foi monitorado durante a rejeição do xenoenxerto por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas. Primers específicos de espécies foram então usados para quantificar cpsDNA por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de artéria de porco para macaco. O valor deste método sugere que ele pode ser usado como um método simples, conveniente, de baixo custo e menos invasivo para monitorar a rejeição imune da xenotransplante.

Introdução

A falência de órgãos é uma das principais causas de morte¹. O transplante de células, tecidos e órgãos é uma forma eficaz de tratar a falência de órgãos². No entanto, a escassez de órgãos doadores limita a aplicação clínica deste método^3,4. Estudos têm demonstrado que os suínos podem ser usados como fonte potencial de órgãos humanos para transplante clínico^5,6. No entanto, o transplante de órgãos entre espécies enfrenta perigosa rejeição imunológica. Portanto, é crucial monitorar a rejeição imune da xenot....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes do Conselho de Revisão Institucional do Hospital do Segundo Povo de Shenzhen, Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Shenzhen.

1. Projete primers específicos de suínos

1. Realize a análise blast de genoma inteiro para identificar genes específicos suínos que eram diferentes dos humanos, macacos ou camundongos, usando o software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2. Projete primers de acordo com 19 genes específicos para porcos(Tabela 1) usando o software do Primer 5.

2. Isolando o DNA g....

Resultados

Neste protocolo foram projetados primers específicos porcina, fragmentos de DNA específicos contendo plasmídeos contendo suínos foram construídos, e curvas padrão para a quantitação foram estabelecidas(Figura 4). As especificidades das espécies dos 19 primers foram confirmadas pela PCR. Primers específicos de espécies (primer #4 e primer #11) foram então usados para quantificar cpsDNA por qPCR em modelos de transplante de células de porco para rato e modelos de transplante de remendo de arté.......

Discussão

Quantificar o DNA circulante de suínos representa uma abordagem viável para monitorar a rejeição imune da xenotransplante. Gadi et al.²⁴ descobriram que o conteúdo de DNA circulante derivado do doador (ddcfDNA) no sangue de pacientes com rejeição aguda foi significativamente maior do que o de pacientes sem rejeição. Esses estudos sugerem que o DDCFDNA pode ser um biomarcador comum para monitorar danos ao enxerto de órgãos. Nos últimos anos, a QPCR tem sido cada vez mais aplicada à análise de ácido.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Biowest, Barcelona, Espanha	111860
BamHI-HF	New England Biolabs, Ipswich, Mass, EUA	R3136S
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	Axygen  Biosciences, Union City, CA, EUA	MCT-150-C
Tubo de PCR de 0,2 mL	Axygen  Biociências, Union City, CA, EUA	PCR-02-C
C57BL/6 Centro	de Animais Médicos de Ratos da Província de Guangdong,  China		8~10 semanas
Centrífuga	Térmica  Fisher Scientific, Walt-ham, MA, EUA	Micro 21R
2-Log DNA Ladder	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	N3200S	0.1– 10.0 kb
Marcador I	Tiangen, Pequim, China	MD101-02	0.1– Coluna Mini de DNA de 0,6 kb
(Colunas Mini de DNA HiBind)	Omega Bio-tek, Norcross, GA, EUA	DNACOL-01
Buffer de carregamento de DNA	Solarbio, Pequim, China	D1010
E.Z.N.A.Kit Mini de DNA de Plasmídeo I e E.Z.N.A. Kit Mini de DNA de Plasmídeo II	Omega Bio-tek, Norcross, GA, EUA	D6942
D6943
EcoR I	Takara  Bio, Shiga, Japão	biotecnologia
mini	, Shenzhen, China		2~4 meses
de jogo genômico da extração do ADN?	Tiangen, Pequim, China	DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo, Osaka, Japão	QPK-201
Gel Doc XR	Bio-Rad, Hércules, EUA
Macacos cynomolgus machos	Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China		8 anos
Corante de ácido nucleico (Gelred)	Biotium, Fremont, EUA	42003
polimerase(Premix Taq)	Takara  Bio, Shiga, Japão	RR901A
pMD19-T plasmídeo	Takara  Bio, Shiga, máquina	D102A
	, Waltham, jogo
	, Pequim, China	DP339
TAE	sangon Biotech, Shanghai, China	B548101

fêmea da arca dos porcos BGI de Bama 1040S Applied Biosystems QSDx da máquina do qPCR de Japão Tiangen da extração do soro/ADN de circulação dos EUA