एक Xenotransplantation मॉडल के रक्त में सुअर विशिष्ट डीएनए परिसंचारी की मात्राकरण
Summary
इस प्रोटोकॉल में, पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर डिजाइन किए गए थे, प्लाज्मिड युक्त पोर्सिन विशिष्ट डीएनए टुकड़े बनाए गए थे, और क्वांटिटेशन के लिए मानक घटता स्थापित किया गया था। प्रजातियों के विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करते हुए, सीपीएसडीएनए को क्यूपीसीआर द्वारा सुअर-से-माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल और सुअर-से-बंदर धमनी पैच प्रत्यारोपण मॉडल में निर्धारित किया गया था।
Abstract
ज़ेनोट्रांज्लांटेशन अंग विफलता के इलाज के लिए एक व्यवहार्य तरीका है। हालांकि, कैसे प्रभावी ढंग से xenotransplantation की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी के लिए चिकित्सकों और शोधकर्ताओं के लिए एक समस्या है । यह पांडुलिपि सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल और सुअर से बंदर धमनी पैच प्रत्यारोपण मॉडल में प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का वर्णन करता है । परिसंचारी डीएनए अंग क्षति के लिए एक संभावित गैर आक्रामक बायोमार्कर है । इस अध्ययन में, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा xenograft अस्वीकृति के दौरान परिसंचारी सुअर-विशिष्ट डीएनए (cpsDNA) पर नजर रखी गई थी। इस प्रोटोकॉल में, पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर डिजाइन किए गए थे, प्लाज्मिड युक्त पोर्सिन विशिष्ट डीएनए टुकड़े बनाए गए थे, और क्वांटिटेशन के लिए मानक घटता स्थापित किया गया था। प्रजातियों के विशिष्ट प्राइमर तो सुअर से माउस सेल प्रत्यारोपण मॉडल और सुअर से बंदर धमनी पैच प्रत्यारोपण मॉडल में qPCR द्वारा cpsDNA मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इस विधि के मूल्य से पता चलता है कि इसे एक सरल, सुविधाजनक, कम लागत और कम आक्रामक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि ज़ेनोट्रांज्लांटेशन की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी की जा सके।
Introduction
अंग न होना मृत्यु के मुख्य कारणों में से एक है1. कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों का प्रत्यारोपण अंग विफलता के इलाज के लिए एक प्रभावी तरीका है2। फिर भी, दाता अंगों की कमी इस विधि के नैदानिक अनुप्रयोग को सीमित करता है3,4. अध्ययनों से पता चला है कि सूअरों का उपयोग नैदानिक प्रत्यारोपण के लिए मानव अंगों के संभावित स्रोत के रूप में किया जा सकता है5,6. हालांकि, क्रॉस-प्रजाति अंग प्रत्यारोपण खतरनाक प्रतिरक्षा अस्वीकृति का सामना करता है। इसलिए, ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, प्रतिरक्षा अस्वीकृति की नैदानिक निगरानी मुख्य रूप से रोगी के संकेतों और लक्षणों पर निर्भर करती है, साथ ही प्रयोगशाला परीक्षण (जैसे, बायोप्सी, इम्यूनोबायोकेमिकल विश्लेषण, और अल्ट्रासाउंड)7,8,9। हालांकि, इन निगरानी विधियों के कई नुकसान हैं। रोगियों में प्रतिरक्षा अस्वीकृति के लक्षण और लक्षण आमतौर पर10देर से दिखाई देते हैं, जो जल्दी पता लगाने और जल्दी हस्तक्षेप के लिए अनुकूल नहीं है; बायोप्सी में आक्रामक11होने का नुकसान होता है, जो रोगियों के लिए स्वीकार करना आसान नहीं होता है; इम्यूनोबायोकेमिकल विश्लेषण में संवेदनशीलता या विशिष्टता का अभाव है, और अल्ट्रासाउंड सहायक और महंगा है। इसलिए, प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी के लिए एक प्रभावी और सुविधाजनक विधि खोजना जरूरी है।
परिसंचारी डीएनए रक्त में पाया डीएनए का एक बाह्य प्रकार है । मंडेल और मेटाइस12 ने सबसे पहले १९४८ में परिधीय रक्त में डीएनए परिसंचारी की उपस्थिति की सूचना दी । सामान्य शारीरिक परिस्थितियों में, स्वस्थ लोगों के रक्त में डीएनए परिसंचारी बेसलाइन पर अपेक्षाकृत कम है। हालांकि, ट्यूमर, मायोकार्डियल इन्फेक्शन, ऑटोइम्यून रोगों और प्रत्यारोपण अस्वीकृति जैसी कुछ विकृतियों में, रक्त में परिसंचारी डीएनए के स्तर को एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस के कारण परिसंचारी डीएनए की भारी रिहाई के कारण13,14 में काफी वृद्धि की जा सकती है। परिसंचारी डीएनए की उत्पत्ति एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस15से जुड़ी हुई है , जो16को ज़ेनोबेड़ा अस्वीकृति की विशेषता है ।
परिसंचारी डीएनए 17,18 ,19के कैंसर का पता लगाने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव बायोमार्कर साबित हुआ है । अंग प्रत्यारोपण20, 21के बाद अस्वीकृति का पता लगाने के लिए दाता-व्युत्पन्न परिसंचारी डीएनए का उच्च माध्यम से अनुक्रमण विश्वसनीय है । हालांकि, इस विधि के लिए एक उच्च एकाग्रता और निकाले गए डीएनए की गुणवत्ता की आवश्यकता होती है। उच्च लागत और समय की खपत के अलावा डीएनए आवश्यकताएं इस विधि को नियमित नैदानिक उपयोग के लिए अयोग्य बनाती हैं। दाता-व्युत्पन्न परिसंचारी डीएनए को मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा सटीक रूप से निर्धारित किया जा सकता है, जो विशिष्ट और संवेदनशील दोनों है। इसलिए, क्यूपीसीआर द्वारा डीएनए परिसंचारी पोर्सिन की मात्रा बताना एक व्यवहार्य तरीका है जो ज़ेनोट्रांज्लांटेशन की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी करता है। यह कम आक्रामक, अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट, कम लागत, और समय की बचत है। सूअर और मनुष्य आनुवंशिक रूप से काफी अलग जीनोमिक दृश्यों(चित्रा 1)के साथ अलग हैं । इसलिए, परिसंचारी पोर्सिन डीएनए को ज़ीनो-अस्वीकृति के कारण प्राप्तकर्ता के रक्त के बाद-ज़ेनोट्रांज्लांटेशन में जारी किया जा सकता है। सीपीएसडीएनए को प्राप्तकर्ता के रक्त में प्रजातियों-विशिष्ट प्राइमर के साथ क्यूपीसीआर द्वारा ठीक से निर्धारित किया जा सकता है। इससे पहले, हमने22, 23के लिए बायोमार्कर के रूप में सीपीएसडीएनए के औचित्य और व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है । यहां, हम अधिक प्रयोगात्मक सुझावों और विवरणों का खुलासा करते हैं। प्रयोग में निम्नलिखित चरण होते हैं। सबसे पहले, पोर्सिन विशिष्ट प्राइमर डिजाइन किए गए थे, और जीनोमिक डीएनए को अलग-थलग कर दिया गया था, जिसका उपयोग नियमित पीसीआर द्वारा प्राइमर की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए किया जाता था। दूसरा, सीपीएसडीएनए के मानक वक्र का निर्माण करना और सीपीएसडीएनए को सैंपल ब्लड से अलग करना। अंत में, परिसंचारी सुअर विशिष्ट डीएनए qPCR का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गया था ।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए परिसंचारी पोर्सिन की मात्रा निर्धारित करना ज़ेनोट्रांज्लांटेशन की प्रतिरक्षा अस्वीकृति की निगरानी करने के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। गादी एट अल24 ने पाया कि …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFC1103704), शेनझेन फाउंडेशन ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (JCYJ201708172116272), गुआंगदोंग प्रांत में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष धन (2017YFC1103704) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । 2019), शेनझेन में चिकित्सा परियोजना (SZSM201412020), शेनझेन के उच्च स्तरीय चिकित्सा अनुशासन निर्माण के लिए निधि (2016031638), शेर्ज़ेन फाउंडेशन ऑफ हेल्थ एंड फैमिली प्लानिंग कमीशन (SZXJ2017021 , SZXJ2018059) ।
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
Referências
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2019).
- Lopez-Fraga, M., et al. A needed Convention against trafficking in human organs. Lancet. 383 (9936), 2187-2189 (2014).
- Sykes, M., Sachs, D. Transplanting organs from pigs to humans. Science immunology. 4 (41), 6298 (2019).
- Reardon, S. New life for pig-to-human transplants. Nature. 527 (7577), 152-154 (2015).
- Song, Z., Cooper, D. K., Mou, Z. Expression and Regulation Profile of Mature MicroRNA in the Pig: Relevance to Xenotransplantation. BioMed Research International. 2018, 2983908 (2018).
- Chung, H., et al. CD4(+) /CD8(+) T-cell ratio correlates with the graft fate in pig-to-non-human primate islet xenotransplantation. Xenotransplantation. 27 (2), 12562 (2020).
- Yoon, C. H., Choi, S. H., Lee, H. J., Kang, H. J., Kim, M. K. Predictive biomarkers for graft rejection in pig-to-non-human primate corneal xenotransplantation. Xenotransplantation. 26 (4), 12515 (2019).
- Agbor-Enoh, S., et al. Circulating cell-free DNA as a biomarker of tissue injury: Assessment in a cardiac xenotransplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 37 (8), 967-975 (2018).
- Vito Dabbs, D., et al. Are symptom reports useful for differentiating between acute rejection and pulmonary infection after lung transplantation. Heart & Lung. 33 (6), 372-380 (2004).
- Miller, C. A., et al. Non-invasive approaches for the diagnosis of acute cardiac allograft rejection. Heart. 99 (7), 445-453 (2013).
- Mandel, P., Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. Comptes Rendus des Seances de l Academie des Sciences. 142 (3-4), 241-243 (1948).
- Okkonen, M., et al. Plasma cell-free DNA in patients needing mechanical ventilation. Critical Care. 15 (4), 196 (2011).
- Wagner, J. Free DNA–new potential analyte in clinical laboratory diagnostics. Biochemia Medica. 22 (1), 24-38 (2012).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
- Mohiuddin, M. M., et al. Chimeric 2C10R4 anti-CD40 antibody therapy is critical for long-term survival of GTKO.hCD46.hTBM pig-to-primate cardiac xenograft. Nature Communications. 7, 11138 (2016).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. New England Journal of Medicine. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature Medicine. 20 (5), 548-554 (2014).
- Snyder, T. M., Khush, K. K., Valantine, H. A., Quake, S. R. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6229-6234 (2011).
- De Vlaminck, I., et al. Noninvasive monitoring of infection and rejection after lung transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13336-13341 (2015).
- Zhou, M., et al. Circulating pig-specific DNA as a novel biomarker for monitoring xenograft rejection. Xenotransplantation. 26 (4), 12522 (2019).
- Huo, Q., et al. Circulating mi RNA or circulating DNA —Potential biomarkers for organ transplant rejection. Xenotransplantation. 26 (1), 12444 (2019).
- Gadi, V. K., Nelson, J. L., Boespflug, N. D., Guthrie, K. A., Kuhr, C. S. Soluble donor DNA concentrations in recipient serum correlate with pancreas-kidney rejection. Clinical Chemistry. 52 (3), 379-382 (2006).
