Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto
Summary
In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. Utilizzando primer specifici per specie, cpsDNA è stato quantificato da qPCR in modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia.
Abstract
Lo xenotrapianto è un metodo fattibile per trattare l’insufficienza d’organo. Tuttavia, come monitorare efficacemente il rifiuto immunitario dello xenotrapianto è un problema per medici e ricercatori. Questo manoscritto descrive un metodo semplice ed efficace per monitorare il rigetto immunitario nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il DNA circolante è un biomarcatore potenzialmente non invasivo per il danno agli organi. In questo studio, il DNA circolante specifico del maiale (cpsDNA) è stato monitorato durante il rigetto dello xenograft mediante PCR quantitativo in tempo reale (qPCR). In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. I primer specifici per specie sono stati quindi utilizzati per quantificare il cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il valore di questo metodo suggerisce che può essere usato come metodo semplice, conveniente, a basso costo e meno invasivo per monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto.
Introduction
L’insufficienza d’organo è una delle principali cause dimorte 1. Il trapianto di cellule, tessuti e organi è un modo efficace per trattare l’insufficienzad’organo 2. Tuttavia, la carenza di organi donatori limita l’applicazione clinica di questometodo 3,4. Gli studi hanno dimostrato che i maiali possono essere utilizzati come potenziale fonte di organi umani per il trapiantoclinico 5,6. Tuttavia, il trapianto di organi tra specie deve affrontare un pericoloso rifiuto immunitario. Pertanto, è fondamentale monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto. Attualmente, il monitoraggio clinico del rigetto immunitario dipende principalmente dai segni e dai sintomi del paziente, nonché dai test di laboratorio (ad esempio biopsia, analisi immunobiochimica ed ecografia)7,8,9. Tuttavia, questi metodi di monitoraggio hanno molti svantaggi. I segni e i sintomi del rigetto immunitario nei pazienti di solitocompaiono alla fine del 10, il che non favorisce la diagnosi precoce e l’intervento precoce; la biopsia ha lo svantaggio di essereinvasiva 11, il che non è facile da accettare per i pazienti; l’analisi immunobiochimica manca di sensibilità o specificità e gli ultrasuoni sono ausiliari e costosi. Pertanto, è urgente trovare un metodo efficace e conveniente per monitorare il rifiuto immunitario.
Il DNA circolante è un tipo extracellulare di DNA trovato nel sangue. Mandel e Metais12 riportarono per la prima volta la presenza di DNA circolante nel sangue periferico nel 1948. In condizioni fisiologiche normali, il DNA circolante nel sangue di persone sane è relativamente basso al basale. Tuttavia, in alcune patologie, come tumori, infarto del miocardio, malattie autoimmuni e rigetto del trapianto, il livello di DNA circolante nel sangue può essere significativamenteaumentato 13,14 a causa del rilascio massiccio di DNA circolante causato da apoptosi e necrosi. L’origine del DNA circolante è associata all’apoptosi e alla necrosi15, che sono caratteristiche del rifiuto dello xenografto16.
Il DNA circolante ha dimostrato di essere un biomarcatore mini-invasivo per il rilevamento deitumori 17,18,19. Il sequenziamento elevato del DNA circolante derivato dal donatore è affidabile per il rilevamento del rigetto dopo il trapianto diorgani 20,21. Tuttavia, questo metodo richiede un’alta concentrazione e qualità del DNA estratto. I requisiti del DNA oltre all’elevato costo e al consumo di tempo rendono questo metodo non idoneo per l’uso clinico di routine. Il DNA circolante derivato dal donatore può essere quantificato con precisione dalla PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), che è allo stesso tempo specifica e sensibile. Pertanto, quantificare il DNA circolante suino mediante qPCR è un metodo fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. Questo è meno invasivo, altamente sensibile e specifico, a basso costo e risparmio di tempo. I suini e gli esseri umani sono geneticamente separati con sequenze genomiche molto diverse (Figura 1). Pertanto, il DNA suino circolante può essere rilasciato nel sangue del ricevente dopo lo xenotrapianto a causa dello xeno-rifiuto. CpsDNA potrebbe essere quantificato con precisione da qPCR con primer specifici per specie nel sangue del ricevente. In precedenza, abbiamo dimostrato la logica e la fattibilità del cpsDNA come biomarcatore per lo xenotrapianto22,23. Qui, divulghiamo suggerimenti e dettagli più sperimentali. L’esperimento consiste nei seguenti passaggi. In primo luogo, sono stati progettati primer specifici suiini e il DNA genomico è stato isolato, che è stato utilizzato per verificare la specificità dei primer dalla NORMALE PCR. In secondo luogo, costruire la curva standard di cpsDNA e isolare cpsDNA dal sangue campione. Infine, il DNA circolante specifico del maiale è stato quantificato utilizzando qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificare il DNA circolante suina rappresenta un approccio fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. 24 hanno scoperto che il contenuto di DNA circolante derivato dal donatore (ddcfDNA) nel sangue dei pazienti con rigetto acuto era significativamente superiore a quello dei pazienti senza rifiuto. Questi studi suggeriscono che il ddcfDNA può essere un biomarcatore comune per il monitoraggio dei danni da innesto degli organi. Negli ultimi anni, qPCR è stato sempre pi?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nel Guangdong Provincia (2019), Sanming Project of Medicine a Shenzhen (SZSM201412020), Fondo per la costruzione di discipline mediche di alto livello di Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).
Materials
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit Ⅰ | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
Referências
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