Detta protokoll beskriver användningen av kisel nanotrådar för intracellulära optisk bio-modulering av cell i en enkel och lätt att utföra metod. Tekniken är mycket anpassningsbar till olika celltyper och kan användas för in vitro- såväl som in vivo-applikationer.
Myofibroblasts kan spontant internalisera kisel nanotrådar (SiNWs), vilket gör dem till ett attraktivt mål för bioelektroniska applikationer. Dessa cell-kisel hybrider erbjuder blyfri optisk modulering kapacitet med minimala perturbation till normala cell beteende. De optiska funktionerna erhålls genom sinws fototermiska och fotoelektriska egenskaper. Dessa hybrider kan skördas med hjälp av standard vävnadskultur tekniker och sedan tillämpas på olika biologiska scenarier. Vi visar här hur dessa hybrider kan användas för att studera elektrisk koppling av hjärtceller och jämföra hur myofibroblasts par till varandra eller till kardiomyocyter. Denna process kan åstadkommas utan specialutrustning bortom ett fluorescerande mikroskop med kopplade laserlinjen. Också visas är användningen av en specialbyggd MATLAB rutin som gör att kvantifiering av kalcium förökning inom och mellan de olika cellerna i kulturen. Myofibroblasts visas ha en långsammare elektrisk respons än cardiomyocytes. Dessutom visar den myofibroblast intercellulära förökningen något långsammare, men jämförbara hastigheter till deras intracellulära hastigheter, vilket tyder på passiv förökning genom gap korsningar eller nanorör. Denna teknik är mycket anpassningsbar och kan enkelt tillämpas på andra cellulära arenor, för in vitro samt in vivo eller ex vivo undersökningar.
Alla biologiska organismer använder elektricitet, i form av joner, för att reglera det cellulära beteendet. Cellmembran innehåller olika typer av specifika jonkanaler som möjliggör passiv och aktiv transport av joner. Dessa joner styr funktionerna i retbara celler, såsom neuronal aktivitet och skelett och hjärt muskel kontraktilitet. Bioelektricitet spelar dock också en viktig roll i icke-retbara celler, som styr många cellulära funktioner såsom cellproliferation1, neuroimmunity2,3,4, och stamcellsdifferentiering5.
Under de senaste decennierna har området bioelektricitet dragit ett ökande intresse, vilket har bidragit till utvecklingen av ett flertal tekniker för bioelektroniska gränssnitt. Mikroelektrod patch pipetter är guldmyntfoten för intracellulär inspelning och stimulering6. I denna metodik dras en glaspipett under särskilda förhållanden för att bilda en skarp kant med en porstorlek på få mikrometer. Denna pipetten är fylld med en buffert och pipetten möjliggör direktkontakt av bufferten med den intracellulära volymen. Detta resulterar i ett bioelektriskt gränssnitt som ger extremt hög signal till brusförhållanden, exakt kontroll över cellulär elektrisk aktivitet och extremt hög temporal upplösning. Även om denna metod är ett extremt kraftfullt verktyg, som nyligen var nedskalad till en nano-pipetkonfiguration7, är det förknippat med flera viktiga tekniska begränsningar. Cytosolspädningseffekten8, liksom mekaniska vibrationer, begränsar dess nytta till kortfristiga förhör, och det kräver dyr specialiserad utrustning och en hög nivå av teknisk skicklighet. Dessutom begränsar dess skrymmande antalet celler som kan registreras eller stimuleras samtidigt, och på grund av dess invasivitet, det kan inte konfigureras under ett experiment. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades mikroelektroder, men storleken på elektroderna begränsar den rumsliga upplösningen samt intracellulär åtkomst. Nanoelektroderrayer tillåter intracellulär inspelning och stimulering men kräver slipande elektroporation för att komma åt cytosol9,10. Dessutom är alla dessa metoder substratbundna och är därmed begränsade till in vitro-cellkulturer, eller till externa ytliga celler, utan tillgång till celler som finns inuti en 3-dimensionell (3D) vävnad.
Optogenetics11 används ofta för att ta itu med dessa 3D och in vivo begränsningar. Optogenetiska metoder är dock baserade på de perturbations av ljusaktiverade plasmamembran jonkanaler som distribueras vid plasmamembranet, begränsa 3D spatial upplösning12 och intracellulära kapacitet.
Vi har nyligen visat att kisel nanotrådar (SiNWs) kan användas för att utföra intracellulära bioelektriska förhör med submicron rumslig upplösning med olika icke-retbara celler, nämligen hjärt myofibroblasts och oligodendrocytes13. Dessutom använde vi dessa SiNWs att utföra ex-vivo cell specifika förhör inom en 3D-hjärt vävnad, att undersöka hur hjärtceller elektriskt par in vivo14. En stor fördel med denna metodik är dess enkelhet; det inte kräver någon genetisk modifiering eller skrymmande instrumentering. Många celler kommer spontant internalisera foto-lyhörda SiNWs med inget behov av ultraljudsbehandling eller elektroporation15. Dessutom kommer de att spontant fly den endosomala inkapsling och bilda en sömlös integration med cytosol och intracellulära organeller13,15. Dessa cell-SiNWs kompositer, kallas cell-kisel hybrider, besitter den dynamiska, mjuka och mångsidiga karaktär ursprungliga cellen, liksom optoelektriska kapacitet SiNWs. Efter hybridisering kan cell-SiNW hybrid skördas med hjälp av standard vävnadskultur tekniker och används för olika tillämpningar såsom intracellulära bioelektrisk stimulering; studera intercellulär bioelektrisk koppling in vitro; och för in vivo cell specifika förhör. Som en effektiv stimulering kräver samlokalisering av hög optisk effekt tätheter och SiNWs, kan man uppnå hög rumslig upplösning både i 2D och 3D. I detta protokoll beskriver vi i detalj metodiken, samt hur resultaten kan analyseras. Fokus läggs på den intra- och intercellulära undersökningen in vitro, men in vivo-implementeringen av denna metodik kan direkt utnyttjas för många andra biologiska scenarier.
Vi har här visat ett enkelt sätt att utföra intracellulär elektrisk stimulering av celler. I denna demonstration använde vi MFs som prehybridized med SiNWs, sedan samkulturerade med CMs. I allmänhet har de flesta prolifereringsceller tendensen att internalisera SiNWs, vilket möjliggör användning av denna metodik med många andra celltyper. Dessutom, medan vi visat den intracellulära stimulering av celler, kan samma principer användas för att utföra extracellulära stimulering av celler. Detta kan göras geno…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av flygvapnets kontor för vetenskaplig forskning (AFOSR FA9550-18-1-0503).
35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |