Silicium nanodraden en optische stimulatie voor onderzoeken van intra- en intercellulaire elektrische koppeling
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van silicium nanodraden voor intracellulaire optische bio-modulatie van cellen in een eenvoudige en eenvoudig uit te voeren methode. De techniek is zeer aanpasbaar aan diverse celtypes en kan zowel in vitro als in vivo toepassingen worden gebruikt.
Abstract
Myofibroblasts kunnen siliciumnanodraden (SiNWs) spontaan internaliseren, waardoor ze een aantrekkelijk doelwit zijn voor bio-elektronische toepassingen. Deze cel-silicium hybriden bieden loodloze optische modulatie mogelijkheden met minimale verstoring van normaal celgedrag. De optische mogelijkheden worden verkregen door de fotothermale en foto-elektrische eigenschappen van SiNWs. Deze hybriden kunnen worden geoogst met behulp van standaard weefselkweektechnieken en vervolgens worden toegepast op verschillende biologische scenario’s. We laten hier zien hoe deze hybriden kunnen worden gebruikt om de elektrische koppeling van hartcellen te bestuderen en te vergelijken hoe myofibroblasts met elkaar koppelen of met cardiomyocyten. Dit proces kan worden bereikt zonder speciale apparatuur buiten een fluorescerende microscoop met gekoppelde laserlijn. Ook getoond is het gebruik van een op maat gemaakte MATLAB routine die het mogelijk maakt de kwantificering van calcium voortplanting binnen en tussen de verschillende cellen in de cultuur. Myofibroblasts blijken een tragere elektrische respons te hebben dan die van cardiomyocyten. Bovendien vertoont de myofibroblast intercellulaire voortplanting iets langzamer, hoewel vergelijkbare snelheden als hun intracellulaire snelheden, wat wijst op passieve voortplanting door gapverbindingen of nanobuisjes. Deze techniek is zeer aanpasbaar en kan gemakkelijk worden toegepast op andere cellulaire arena’s, voor zowel in vitro als in vivo of ex vivo onderzoeken.
Introduction
Alle biologische organismen gebruiken elektriciteit, in de vorm van ionen, om het cellulaire gedrag te reguleren. Celmembranen bevatten verschillende soorten specifieke ionenkanalen waardoor het passieve en actieve transport van ionen mogelijk is. Deze ionen regelen de functies van prikkelbare cellen, zoals neuronale activiteit en skelet- en hartspiercontractiliteit. Bio-elektriciteit speelt echter ook een belangrijke rol in niet-prikkelbare cellen, waarbij veel cellulaire functies worden geregeld, zoals celproliferatie1, neuro-immuniteit2,3,4en stamceldifferentiatie5.
In de afgelopen decennia heeft het gebied van de bio-elektrische sector een toenemende belangstelling getrokken, wat heeft bijgedragen aan de ontwikkeling van tal van technologieën voor bio-elektronische interfaces. Microelectrode patchpipets zijn de gouden standaard van intracellulaire opname en stimulatie6. In deze methode wordt een glazen pipet getrokken onder specifieke omstandigheden om een scherpe rand te vormen met een poriegrootte van enkele micron. Deze pipet is gevuld met een buffer en de pipet maakt direct contact van de buffer met het intracellulaire volume mogelijk. Dit resulteert in een bio-elektrische interface die extreem hoge signaal-ruisverhoudingen, nauwkeurige controle over cellulaire elektrische activiteit en extreem hoge temporele resolutie oplevert. Hoewel deze methode is een zeer krachtig instrument, die onlangs werd opgeschaald naar een nano-pipet configuratie7, het wordt geassocieerd met een aantal belangrijke technische beperkingen. Het cytosol verdunningseffect 8 ,evenalsmechanische trillingen, beperkt zijn nut tot korte termijn ondervragingen, en het vereist dure gespecialiseerde apparatuur en een hoog niveau van technische vaardigheid. Bovendien beperkt de omvangrijkheid het aantal cellen dat tegelijkertijd kan worden geregistreerd of gestimuleerd, en vanwege de invasieve werking ervan kan het niet opnieuw worden geconfigureerd tijdens een experiment. Om deze beperkingen te overwinnen, werden micro-elektroden arrays ontwikkeld, maar de grootte van de elektroden beperkt de ruimtelijke resolutie en intracellulaire toegang. Nanoelectrode arrays maken intracellulaire opname en stimulatie mogelijk, maar vereisen schurende elektrovissing om toegang te krijgen tot de cytosol9,10. Bovendien zijn al deze methoden substraatgebonden en zijn dus beperkt tot in vitro celculturen, of tot externe oppervlakkige cellen, zonder toegang tot cellen die zich in een 3-dimensionaal (3D) weefsel bevinden.
Optogenetica11 wordt veel gebruikt om deze 3D- en in vivo-beperkingen aan te pakken. Optogenetische methoden zijn echter gebaseerd op de verstoringen van lichtgeactiveerde plasmamembraanionkanalen die op het plasmamembraan worden verdeeld, waardoor de 3D ruimtelijke resolutie12 en intracellulaire vermogens worden beperkt.
We hebben onlangs aangetoond dat silicium nanodraden (SiNWs) kan worden gebruikt om intracellulaire bio-elektrische ondervraging uit te voeren met submicron ruimtelijke resolutie met verschillende niet-excitable cellen, namelijk cardiale myofibroblasten en oligodendrocyten13. Bovendien gebruikten we deze SiNW’s om ex-vivo celspecifieke ondervragingen uit te voeren binnen een 3D-hartweefsel, om te onderzoeken hoe hartcellen elektrisch in vivo14koppelen. Een groot voordeel van deze methodologie is de eenvoud; het vereist geen genetische modificatie of omvangrijke instrumentatie. Veel cellen zullen spontaan fotoresponsieve SiNWs internaliseren zonder dat er sonicatie of elektroporatienodig is 15. Bovendien zullen ze spontaan ontsnappen aan de endosomale inkapseling en een naadloze integratie vormen met de cytosol en intracellulaire organellen13,15. Deze cel-SiNWs composieten, genoemd cel-silicium hybriden, bezitten de dynamische, zachte en veelzijdige aard van de oorspronkelijke cel, evenals de optoelectric mogelijkheden van de SiNWs. Na hybridisatie kan de cel-SiNW hybride worden geoogst met behulp van standaard weefselkweektechnieken en worden gebruikt voor verschillende toepassingen zoals intracellulaire bio-elektrische stimulatie; het bestuderen van intercellulaire bio-elektrische koppeling in vitro; en voor in vivo celspecifieke ondervraging. Aangezien een effectieve stimulatie co-lokalisatie van hoge optische vermogensdichtheden en SiNWs vereist, kan men een hoge ruimtelijke resolutie bereiken, zowel in 2D als in 3D. In dit protocol beschrijven we in detail de methodologie, evenals hoe de resultaten kunnen worden geanalyseerd. De focus ligt op het intra- en intercellulair onderzoek in vitro, maar de in vivo implementatie van deze methodologie kan direct worden gebruikt voor vele andere biologische scenario’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben hier een eenvoudige manier aangetoond om intracellulaire elektrische stimulatie van cellen uit te voeren. In deze demonstratie gebruikten we MF’s die werden gefhybridiseerd met SiNWs, vervolgens co-gekweekt met CMs. In het algemeen hebben de meeste zich vermenigvuldigende cellen de neiging om SiNWs te internaliseren, waardoor het gebruik van deze methode met vele andere celtypen mogelijk is. Bovendien, terwijl we de intracellulaire stimulatie van cellen hebben aangetoond, kunnen dezelfde principes worden gebrui…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door het Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
Referências
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- . dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020)
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
