Nanofils de silicium et stimulation optique pour les études de couplage électrique intra- et intercellulaire
Summary
Ce protocole décrit l’utilisation de nanofils de silicium pour la biomodulation optique intracellulaire des cellules dans une méthode simple et facile à exécuter. La technique est très adaptable à divers types de cellules et peut être utilisée pour des applications in vitro ainsi que in vivo.
Abstract
Les myofibroblastes peuvent intérioriser spontanément les nanofils de silicium (SiNWs), ce qui en fait une cible attrayante pour les applications bioélectroniques. Ces hybrides cellule-silicium offrent des capacités de modulation optique sans plomb avec une perturbation minimale du comportement cellulaire normal. Les capacités optiques sont obtenues par les propriétés photothermales et photoélectriques des SiNWs. Ces hybrides peuvent être récoltés à l’aide de techniques standard de culture tissulaire, puis appliqués à différents scénarios biologiques. Nous démontrons ici comment ces hybrides peuvent être utilisés pour étudier le couplage électrique des cellules cardiaques et comparer la façon dont les myofibroblastes se couplent les uns aux autres ou aux cardiomyocytes. Ce processus peut être accompli sans équipement spécial au-delà d’un microscope fluorescent avec ligne laser couplée. L’utilisation d’une routine MATLAB sur mesure qui permet la quantification de la propagation du calcium à l’intérieur et entre les différentes cellules de la culture est également démontrée. Les myofibroblastes ont une réponse électrique plus lente que celle des cardiomyocytes. En outre, la propagation intercellulaire myofibroblaste montre des vitesses légèrement plus lentes, bien que comparables à leurs vitesses intracellulaires, suggérant la propagation passive par des jonctions d’écart ou des nanotubes. Cette technique est très adaptable et peut être facilement appliquée à d’autres arènes cellulaires, pour les investigations in vitro ainsi que in vivo ou ex vivo.
Introduction
Tous les organismes biologiques utilisent l’électricité, sous forme d’ions, pour réguler le comportement cellulaire. Les membranes cellulaires contiennent divers types de canaux iions spécifiques permettant le transport passif et actif des ions. Ces ions régissent les fonctions des cellules excitables, telles que l’activité neuronale et la contractilité des muscles squelettiques et cardiaques. Cependant, la bioélectricité joue également un rôle important dans les cellules non excitables, régissant de nombreuses fonctions cellulaires telles que la proliférationcellulaire 1,la neuroimmunité2,3,4, et la différenciation des cellules souches5.
Au cours des dernières décennies, le domaine de la bioélectricité a suscité un intérêt croissant, ce qui a contribué au développement de nombreuses technologies pour les interfaces bioélectroniques. Pipettes patch microélecrode sont l’étalon-or de l’enregistrement intracellulaire et la stimulation6. Dans cette méthodologie, une pipette en verre est tirée dans des conditions spécifiques pour former un bord tranchant avec une taille de pore de quelques microns. Cette pipette est remplie d’un tampon et la pipette permet le contact direct du tampon avec le volume intracellulaire. Il en résulte une interface bioélectrique qui donne des rapports signal/bruit extrêmement élevés, un contrôle précis de l’activité électrique cellulaire et une résolution temporelle extrêmement élevée. Bien que cette méthodologie soit un outil extrêmement puissant, qui a récemment été mis à l’échelle à une configuration nano-pipette7, il est associé à plusieurs limitations techniques importantes. L’effet de dilution cytosol8, ainsi que les vibrations mécaniques, limite son utilité aux interrogatoires à court terme, et il nécessite un équipement spécialisé coûteux et un haut niveau de compétence technique. En outre, son encombrante limite le nombre de cellules qui peuvent être enregistrées ou stimulées simultanément, et en raison de son invasivité, il ne peut pas être reconfiguré tout au long d’une expérience. Pour surmonter ces limitations, des réseaux de microélecrodes ont été développés, mais la taille des électrodes limite la résolution spatiale ainsi que l’accès intracellulaire. Les tableaux nanoélecrodes permettent l’enregistrement et la stimulation intracellulaires mais nécessitent une électroporation abrasive pour accéder au cytosol9,10. En outre, toutes ces méthodologies sont liées au substrat et sont donc limitées aux cultures cellulaires in vitro, ou aux cellules superficielles externes, sans accès aux cellules qui se trouvent à l’intérieur d’un tissu tridimensionnel (3D).
Optogenetics11 est largement utilisé pour répondre à ces limitations 3D et in vivo. Cependant, les méthodes optogénétiques sont basées sur les perturbations des canaux iion de membrane plasmatique activés par la lumière qui sont distribués à la membrane plasmatique, limitant la résolution spatiale 3D12 et les capacités intracellulaires.
Nous avons récemment montré que les nanofils de silicium (SiNWs) peuvent être utilisés pour effectuer un interrogatoire bioélectrique intracellulaire avec résolution spatiale submicron avec différentes cellules non excitables, à savoir les myofibroblastes cardiaques et les oligodendrocytes13. En outre, nous avons employé ces SiNWs pour exécuter l’interrogation spécifique de cellules ex vivo dans un tissu cardiaque 3D, pour étudier comment les cellules cardiaques couplent électriquement in vivo14. Un avantage majeur de cette méthodologie est sa simplicité; il ne nécessite aucune modification génétique ou instrumentation volumineux. De nombreuses cellules intériorisent spontanément les SiNWs photo-sensibles sans avoir besoin de sonication ou d’électroporation15. En outre, ils échapperont spontanément à l’encapsulation endosomale et formeront une intégration transparente avec le cytosol et les organites intracellulaires13,15. Ces composites cell-SiNWs, appelés hybrides cellule-silicium, possèdent la nature dynamique, douce et polyvalente de la cellule d’origine, ainsi que les capacités optoélectriques des SiNWs. Après hybridation, l’hybride cellule-SiNW peut être récolté à l’aide de techniques standard de culture tissulaire et utilisé pour diverses applications telles que la stimulation bioélectrique intracellulaire; étudier le couplage bioélectrique intercellulaire in vitro; et pour un interrogatoire spécifique à la cellule in vivo. Comme une stimulation efficace nécessite la co-localisation de densités de puissance optique élevée et sinws, on peut atteindre une haute résolution spatiale à la fois en 2D et 3D. Dans ce protocole, nous décrivons en détail la méthodologie, ainsi que la façon dont les résultats peuvent être analysés. L’accent est mis sur l’enquête intra- et intercellulaire in vitro, mais la mise en œuvre in vivo de cette méthodologie peut être directement utilisée pour de nombreux autres scénarios biologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons démontré ici un moyen simple d’effectuer la stimulation électrique intracellulaire des cellules. Dans cette démonstration, nous avons utilisé des MF qui ont été préhybridisés avec les SiNWs, puis co-cultivés avec des MC. En général, la plupart des cellules proliférantes ont tendance à intérioriser les SiNWs, ce qui permet l’utilisation de cette méthodologie avec de nombreux autres types de cellules. En outre, tandis que nous avons démontré la stimulation intracellulaire des cellules, les …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux sont appuyés par le Bureau de la recherche scientifique de la Force aérienne (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
Referências
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