ננו-חוטי סיליקון וגירוי אופטי לחקירות של צימוד חשמלי פנים-תאי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש nanowires סיליקון עבור ביו-אפנון אופטי תאי של תא בשיטה פשוטה וקלה לביצוע. הטכניקה ניתנת להתאמה גבוהה לסוגי תאים מגוונים ותוכל לשמש במבחנה, כמו גם ביישומים vivo.
Abstract
Myofibroblasts יכול באופן ספונטני להפנים nanowires סיליקון (SiNWs), מה שהופך אותם יעד אטרקטיבי עבור יישומים ביו-אלקטרוניים. כלאיים אלה של תאים-סיליקון מציעים יכולות אפנון אופטי ללא עופרת עם סטיה מינימלית להתנהגות תאים רגילה. היכולות האופטיות מתקבלות על ידי המאפיינים הפוטותרמיים והפוטואלקטריים של SiNWs. בני כלאיים אלה ניתן לקצור באמצעות טכניקות תרבות רקמות סטנדרטיות ולאחר מכן להחיל על תרחישים ביולוגיים שונים. אנו מדגימים כאן כיצד בני-כלאיים אלה יכולים לשמש כדי ללמוד את הזיווג החשמלי של תאי לב ולהשוות כיצד myofibroblasts זוג אחד לשני או cardiomyocytes. תהליך זה יכול להתבצע ללא ציוד מיוחד מעבר למיקרוסקופ פלורסנט עם קו לייזר בשילוב. כמו כן מוצג השימוש של שגרת MATLAB בהתאמה אישית המאפשרת כימות של הפצת סידן בתוך ובין התאים השונים בתרבות. Myofibroblasts מוצגים יש תגובה חשמלית איטית יותר מזה של cardiomyocytes. יתר על כן, ההתפשטות הבין-תאית myofibroblast מראה מעט איטי יותר, אם כי מהירויות דומות למהירות תאית שלהם, מציע התפשטות פסיבית דרך צמתים פער או צינורות. טכניקה זו היא הסתגלות גבוהה, ניתן להחיל בקלות על זירות סלולריות אחרות, עבור במבחנה, כמו גם בחקירות vivo או לשעבר vivo.
Introduction
כל האורגניזמים הביולוגיים משתמשים בחשמל, בצורה של יונים, כדי לווסת את ההתנהגות התאית. קרום התא מכיל סוגים שונים של ערוצי יונים ספציפיים המאפשרים הובלה פסיבית ופעילה של יונים. יונים אלה שולטים בפונקציות של תאים מרגשים, כגון פעילות עצבית והתכווצות שריר השלד והלבי. עם זאת, ביו-אלקטריות ממלאת תפקיד חשוב גם בתאים שאינם מרגשים, השולטת בפונקציות תאיות רבותכגון התפשטותתאים 1 ,חסינות עצבית 2,3,4,ובידול תאי גזע5.
בעשורים האחרונים, תחום הביו-אלקטריות משך רמה הולכת וגוברת של עניין, אשר תרמה לפיתוח טכנולוגיות רבות עבור ממשקים ביו-אלקטרוניים. פיפטות תיקון Microelectrode הם תקן הזהב של הקלטה תאית וגירוי6. ב מתודולוגיה זו, פיפטה זכוכית נמשך בתנאים ספציפיים כדי ליצור קצה חד עם גודל נקבובית של מיקרון מעט. פיפטה זו מלאה במאגר והפיפטה מאפשרת מגע ישיר של המאגר עם אמצעי האחסון התוך תאי. התוצאה היא ממשק ביו-חשמלי המניב יחסי איתות גבוהים באופן קיצוני לרעש, שליטה מדויקת בפעילות החשמלית הסלולרית ורזולוציית זמן גבוהה באופן קיצוני. למרות מתודולוגיה זו היא כלי רב עוצמה מאוד, אשר לאחרונה הוקטן לתצורת ננו-pipette7, הוא משויך מספר מגבלות טכניות חשובות. אפקט דילול ציטוסול8, כמו גם תנודות מכניות, מגביל את השירות שלה לחקירות קצרות טווח, והוא דורש ציוד מיוחד יקר ורמת מיומנות טכנית גבוהה. יתר על כן, bulkiness שלה מגביל את מספר התאים שניתן להקליט או מגורה בו זמנית, ו בשל פולשניותו, זה לא ניתן להגדיר מחדש לאורך כל ניסוי. כדי להתגבר על מגבלות אלה פותחו מערכי מיקרו-אלקטרודה, אך גודל האלקטרודות מגביל את הרזולוציה המרחבית, כמו גם את הגישה התוך תאית. מערכי Nanoelectrode מאפשרים הקלטה וגירוי תאיים, אך דורשים אלקטרואידיות שוחקת כדי לגשת לציטוסול9,10. בנוסף, כל המתודולוגיות הללו מאוגדים בתחום המיצות ולכן מוגבלות לתרביות תאים במבחנה, או לתאים שטחיים חיצוניים, ללא גישה לתאים שבתוך רקמה תלת-ממדית (תלת-ממדית).
Optogenetics11 משמש נרחב כדי לטפל אלה 3D ובמגבלות vivo. עם זאת, שיטות optogenetic מבוססות על הסטיות של ערוצים יון פלזמה המופעלים באור המופצים על קרום פלזמה, הגבלת הרזולוציה המרחבית 3D12 ויכולות תאיות.
לאחרונה הראנו כי nanowires סיליקון (SiNWs) יכול לשמש לביצוע חקירה ביו-אלקטרית תאית עם רזולוציה מרחבית submicron עם תאים שונים שאינם מרגשים, כלים כלשהם מיופיברובלסטים לב ואוליגודנדרוציטים13. יתר על כן, השתמשנו אלה SiNWs לבצע לשעבר vivo תא חקירה ספציפית בתוך רקמת לב 3D, כדי לחקור כיצד תאי לב זוג חשמלי vivo14. יתרון מרכזי של מתודולוגיה זו הוא הפשטות שלה; זה לא דורש כל שינוי גנטי או מכשור מגושם. תאים רבים באופן ספונטני להפנים SiNWs צילום מגיב ללא צורך sonication או אלקטרואידציה15. בנוסף, הם ימלטו באופן ספונטני מהאנקוסום הא אנדו-אומלי ויתגבשו אינטגרציה חלקה עם האיברים התוךתאיים 13,15. אלה cell-SiNWs מרוכבים, בשם תאים-סיליקון היברידיים, בעל אופי דינמי, רך ורב-תכליתי של התא המקורי, כמו גם את היכולות האופטואלקטריות של SiNWs. לאחר הכלאה, ניתן לקצור את התא-SiNW היברידית באמצעות טכניקות סטנדרטיות של תרבות רקמות ולהשתמש בהן עבור יישומים שונים כגון גירוי ביו-חשמלי תאי; לימוד צימוד ביו-אלקטרי בין-תאי במבחנה; ועל חקירה ספציפית של תא Vivo. מכיוון שגירוי יעיל דורש התאמה אישית של צפיפויות הספק אופטי גבוהות ו-SiNWs, ניתן להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה הן ב-2D והן בתלת-מיד. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפירוט את המתודולוגיה, כמו גם את האופן שבו ניתן לנתח את התוצאות. ההתמקדות מונחת על החקירה הבין-תאית והבין-תאית במבחנה, אך ניתן לנצל את יישום vivo של מתודולוגיה זו באופן ישיר עבור תרחישים ביולוגיים רבים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הראינו כאן דרך פשוטה לבצע גירוי חשמלי תאי של תאים. בהדגמה זו, השתמשנו ב-MFs שהיו מותאמים מראש עם SiNWs, ואז שיתוף פעולה עם CMs. באופן כללי, רוב התאים המתרבים יש נטייה להפנים SiNWs, המאפשר את השימוש מתודולוגיה זו עם סוגי תאים רבים אחרים. יתר על כן, בעוד הראינו את הגירוי תאי של תאים, אותם עקרונות יכולים ל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי משרד המחקר המדעי של חיל האוויר (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
Referências
- Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
- Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
- Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).
- Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).
- Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
- Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
- Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
- Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
- Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).
- Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).
- . dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020)
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).
- Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
- Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
- Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).
- Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
- Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
- He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
- Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
- Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).
