シリコンナノワイヤと細胞間電気結合の研究のための光刺激
Summary
このプロトコルは、細胞内光学バイオ変調のためのシリコンナノワイヤの使用を、簡単かつ容易に行う方法で説明する。この技術は、多様な細胞タイプに適応性が高く、インビトロおよびインビボ用途にも使用できます。
Abstract
筋線維芽細胞はシリコンナノワイヤ(SiWn)を自発的に内部化し、バイオエレクトロニクスアプリケーションの魅力的なターゲットとなっています。これらのセルシリコンハイブリッドは、通常の細胞挙動への摂動を最小限に抑えた、鉛のない光学変調機能を提供します。光学機能は、SiNWの光熱および光電特性によって得られる。これらのハイブリッドは、標準的な組織培養技術を使用して収穫し、異なる生物学的シナリオに適用することができます。ここでは、これらのハイブリッドを使用して心臓細胞の電気結合を研究し、筋線維芽細胞がどのように互いに結合するか、または心筋細胞と比較する方法を実証します。このプロセスは、結合されたレーザーラインを有する蛍光顕微鏡を超える特別な装置なしで達成することができる。また、培養中の異なる細胞内および細胞間のカルシウム伝搬の定量化を可能にするカスタム構築MATLABルーチンの使用も示されている。筋線維芽細胞は、心筋細胞のそれよりも遅い電気応答を有することが示されている。さらに、筋線維芽細胞間伝播は、細胞内速度に匹敵する速度であるが、ギャップ接合部またはナノチューブを介した受動的な伝播を示唆するが、わずかに遅い結果を示す。この技術は非常に適応性が高く、インビボやインビボ調査のために他のセルラーアリーナに簡単に適用できます。
Introduction
すべての生物は、細胞の挙動を調節するために、イオンの形で電気を使用します。細胞膜には、イオンの受動的かつ能動的な輸送を可能にする、さまざまなタイプの特定のイオンチャネルが含まれています。これらのイオンは、神経活動や骨格や心筋収縮などの興奮性細胞の機能を支配する。しかし、生体電気は非興奮性細胞においても重要な役割を果たし、細胞増殖1、神経免疫2、3、4、幹細胞分化5などの多くの細胞機能を支配する。
ここ数十年、バイオ電気の分野は、バイオエレクトロニクスインターフェースのための多くの技術の開発に貢献している、関心の高まりのレベルを引き付けています。マイクロ電極パッチピペットは、細胞内記録および刺激6のゴールドスタンダードである。この方法論では、ガラスピペットを特定の条件下で引っ張り、小さなミクロンの細孔サイズで鋭いエッジを形成します。このピペットはバッファーで満たされ、ピペットは細胞内容積とのバッファーの直接接触を可能にする。これにより、極めて高い信号対雑音比、細胞の電気的活動の正確な制御、および非常に高い時間分解能をもたらす生体電気インターフェースが得られます。この方法論は、最近ナノピペット構成7に縮小された非常に強力なツールですが、いくつかの重要な技術的な制限に関連しています。細胞質ゾル希釈効果8は、機械的振動と同様に、その有用性を短期的な尋問に制限し、高価な特殊な機器と高いレベルの技術スキルを必要とします。さらに、そのかさばりは、同時に記録または刺激することができる細胞の数を制限し、その侵襲性のために、実験全体を通して再構成することはできません。これらの限界を克服するために、マイクロ電極アレイが開発されましたが、電極の大きさは空間分解能と細胞内アクセスを制限します。ナノ電極アレイは細胞内の記録と刺激を可能にするが、細胞質ゾル9、10にアクセスするには研磨エレクトロポレーションが必要である。さらに、これらすべての方法論は基質結合であり、したがって、3次元(3D)組織の内部にある細胞にアクセスしない体外細胞培養物、または外部の表面細胞に限定される。
光遺伝学11 は、これらの3Dおよび生体内の制限に対処するために広く使用されている。しかし、光遺伝学的方法は、原形質膜に分布する光活性化形質膜イオンチャネルの摂動に基づいており、3D空間分解能12 および細胞内能力を制限する。
我々は最近、シリコンナノワイヤ(SiNW)が異なる非興奮性細胞、すなわち心臓筋線維芽細胞およびオリゴデンドロサイト13とのサブミクロン空間分解能を有する細胞内生体電気的尋問を行うために使用できることを示した。さらに、これらのSiNWを用い、3D心臓組織内での元生体細胞特異的な調合を行い、心臓細胞が生体内で電気的に結合する方法を調べる。この方法論の主な利点は、そのシンプルさです。遺伝子組み換えやかさばる計測は必要ありません。多くの細胞は、超音波処理やエレクトロポレーション15を必要とせず、写真応答SiNWsを自発的に内部化します。さらに、それらは、自然に内皮カプセル化を逃れ、細胞質体および細胞内小器官13,15とのシームレスな統合を形成する。これらのセル-SiNW複合材料は、セルシリコンハイブリッドと呼ばれる、元の細胞のダイナミックで柔らかく、汎用性の高い性質だけでなく、SiNWの光電能力を有する。ハイブリダイゼーション後、細胞-SiNWハイブリッドは、標準的な組織培養技術を使用して収穫することができ、細胞内生体電気刺激などの様々な用途に使用することができます。細胞間生体結合を研究するそしてインビボ細胞特異的尋問のために。効果的な刺激は高い光学パワー密度とSiNWの共局在化を必要とするため、2Dと3Dの両方で高い空間分解能を実現できます。このプロトコルでは、方法論と結果の分析方法について詳しく説明します。インビトロでの細胞内および細胞間調査に焦点を当てていますが、この方法論のインビボ実装は、他の多くの生物学的シナリオに直接利用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、細胞の細胞内電気刺激を行う簡単な方法を示しました。このデモでは、SiNW でプレハイブリダイズされた MF を使用し、CM と共培養しました。一般に、増殖する細胞の多くはSiNWを内在化する傾向があり、他の多くの細胞タイプでこの方法論を使用することができます。また、細胞内刺激を実証する一方で、細胞外刺激にも同じ原理を用いることができる。これは、自発的に内部化す…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、空軍科学研究局(AFOSR FA9550-18-1-0503)によってサポートされています。
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
Referências
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