Nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular
Summary
Este protocolo describe el uso de nanohilos de silicio para la biomodulación óptica intracelular de la célula en un método simple y fácil de realizar. La técnica es altamente adaptable a diversos tipos de células y se puede utilizar para aplicaciones in vitro e in vivo.
Abstract
Los miofibroblastos pueden internalizar espontáneamente nanohilos de silicio (SiNW), lo que los convierte en un objetivo atractivo para aplicaciones bioelectrónicas. Estos híbridos de silicio celular ofrecen capacidades de modulación óptica sin plomo con una perturbación mínima para el comportamiento normal de las células. Las capacidades ópticas se obtienen por las propiedades fototérmicas y fotoeléctricas de los SINW. Estos híbridos se pueden cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y luego aplicarse a diferentes escenarios biológicos. Aquí demostramos cómo estos híbridos se pueden utilizar para estudiar el acoplamiento eléctrico de las células cardíacas y comparar cómo los miofibroblastos se unen entre sí o para cardiomiocitos. Este proceso se puede realizar sin equipo especial más allá de un microscopio fluorescente con línea láser acoplada. También se muestra el uso de una rutina MATLAB personalizada que permite la cuantificación de la propagación del calcio dentro y entre las diferentes células en el cultivo. Se ha demostrado que los miofibroblastos tienen una respuesta eléctrica más lenta que la de los cardiomiocitos. Además, la propagación intercelular miofibroblasto muestra velocidades ligeramente más lentas, aunque comparables a sus velocidades intracelulares, lo que sugiere la propagación pasiva a través de uniones de separación o nanotubos. Esta técnica es altamente adaptable y se puede aplicar fácilmente a otras arenas celulares, tanto para investigaciones in vitro como in vivo o ex vivo.
Introduction
Todos los organismos biológicos utilizan electricidad, en forma de iones, para regular el comportamiento celular. Las membranas celulares contienen varios tipos de canales iónicos específicos que permiten el transporte pasivo y activo de iones. Estos iones gobiernan las funciones de las células excitables, como la actividad neuronal y la contractilidad muscular esquelética y cardíaca. Sin embargo, la bioelectricidad también desempeña un papel importante en las células no excitables, gobernando muchas funciones celulares como la proliferación celular1, neuroinmunidad2,3,4, y la diferenciación de células madre5.
En las últimas décadas, el campo de la bioelectricidad ha generado un creciente nivel de interés, lo que ha contribuido al desarrollo de numerosas tecnologías para interfaces bioelectrónicas. Las pipetas de parches de microelectrodo son el estándar de oro de la grabación y estimulación intracelular6. En esta metodología, una pipeta de vidrio se tira en condiciones específicas para formar un borde afilado con un tamaño de poro de pocos micras. Esta pipeta se rellena con un tampón y la pipeta permite el contacto directo del tampón con el volumen intracelular. Esto da como resultado una interfaz bioeléctrica que produce relaciones de señal a ruido extremadamente altas, control preciso sobre la actividad eléctrica celular y una resolución temporal extremadamente alta. Aunque esta metodología es una herramienta extremadamente potente, que recientemente se redujo a una configuración de nano-pipeta7,se asocia con varias limitaciones técnicas importantes. El efecto de dilución delcitosol 8,así como las vibraciones mecánicas, limita su utilidad a los interrogatorios a corto plazo, y requiere costosos equipos especializados y un alto nivel de habilidad técnica. Además, su voluminosidad limita el número de células que se pueden registrar o estimular simultáneamente, y debido a su invasividad, no puede ser reconfigurada a lo largo de un experimento. Para superar estas limitaciones, se desarrollaron matrices de microelectrodos, pero el tamaño de los electrodos limita la resolución espacial, así como el acceso intracelular. Las matrices de nanoelectrodos permiten el registro y la estimulación intracelulares, pero requieren electroporación abrasiva para acceder alcitosol 9,10. Además, todas estas metodologías están unidas al sustrato y, por lo tanto, se limitan a cultivos celulares in vitro, o a células superficiales externas, sin acceso a células que están dentro de un tejido tridimensional (3D).
Optogenetics11 se utiliza ampliamente para abordar estas limitaciones 3D e in vivo. Sin embargo, los métodos optogenéticos se basan en las perturbaciones de los canales iónicos de membrana plasmática activados por la luz que se distribuyen en la membrana plasmática, limitando la resolución espacial 3D12 y las capacidades intracelulares.
Recientemente hemos demostrado que los nanohilos de silicio (SiNW) se pueden utilizar para realizar interrogaciones bioeléctricas intracelulares con resolución espacial submicrónico con diferentes células no excitables, a saber, miofibroblastos cardíacos y oligodendrocitos13. Por otra parte, utilizamos estos SINW para realizar interrogatorios específicos de células ex-vivo dentro de un tejido cardíaco 3D, para investigar cómo las células cardíacas se acoplan eléctricamente in vivo14. Una de las principales ventajas de esta metodología es su simplicidad; no requiere ninguna modificación genética o instrumentación voluminosa. Muchas células internalizarán espontáneamente siNWs foto-sensibles sin necesidad de sonicación o electroporación15. Además, escaparán espontáneamente de la encapsulación endosomal y formarán una integración perfecta con el citosol y los orgánulos intracelulares13,15. Estos compuestos cell-SiNWs, llamados híbridos de silicio celular, poseen la naturaleza dinámica, suave y versátil de la célula original, así como las capacidades optoeléctricas de los SiNW. Después de la hibridación, el híbrido cell-SiNW se puede cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y se utiliza para diversas aplicaciones como la estimulación bioeléctrica intracelular; estudio del acoplamiento bioeléctrico intercelular in vitro; y para el interrogatorio específico de la célula in vivo. Como una estimulación eficaz requiere la co-localización de altas densidades de potencia óptica y SiNWs, se puede lograr una alta resolución espacial tanto en 2D como en 3D. En este protocolo describimos en detalle la metodología, así como cómo se pueden analizar los resultados. El enfoque se centra en la investigación intra e intercelular in vitro, pero la implementación in vivo de esta metodología puede ser utilizada directamente para muchos otros escenarios biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos demostrado aquí una forma sencilla de realizar la estimulación eléctrica intracelular de las células. En esta demostración, usamos MFs que estaban prehibridizados con SINW, luego co-cultivados con CM. En general, la mayoría de las células proliferantes tienen la tendencia a internalizar los SINW, lo que permite el uso de esta metodología con muchos otros tipos de células. Además, si bien demostramos la estimulación intracelular de las células, los mismos principios se pueden utilizar para realizar la es…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
Referências
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