Kiselnanotrådar och optisk stimulering för undersökningar av intra- och intercellulär elektrisk koppling

Summary

Detta protokoll beskriver användningen av kisel nanotrådar för intracellulära optisk bio-modulering av cell i en enkel och lätt att utföra metod. Tekniken är mycket anpassningsbar till olika celltyper och kan användas för in vitro- såväl som in vivo-applikationer.

Abstract

Myofibroblasts kan spontant internalisera kisel nanotrådar (SiNWs), vilket gör dem till ett attraktivt mål för bioelektroniska applikationer. Dessa cell-kisel hybrider erbjuder blyfri optisk modulering kapacitet med minimala perturbation till normala cell beteende. De optiska funktionerna erhålls genom sinws fototermiska och fotoelektriska egenskaper. Dessa hybrider kan skördas med hjälp av standard vävnadskultur tekniker och sedan tillämpas på olika biologiska scenarier. Vi visar här hur dessa hybrider kan användas för att studera elektrisk koppling av hjärtceller och jämföra hur myofibroblasts par till varandra eller till kardiomyocyter. Denna process kan åstadkommas utan specialutrustning bortom ett fluorescerande mikroskop med kopplade laserlinjen. Också visas är användningen av en specialbyggd MATLAB rutin som gör att kvantifiering av kalcium förökning inom och mellan de olika cellerna i kulturen. Myofibroblasts visas ha en långsammare elektrisk respons än cardiomyocytes. Dessutom visar den myofibroblast intercellulära förökningen något långsammare, men jämförbara hastigheter till deras intracellulära hastigheter, vilket tyder på passiv förökning genom gap korsningar eller nanorör. Denna teknik är mycket anpassningsbar och kan enkelt tillämpas på andra cellulära arenor, för in vitro samt in vivo eller ex vivo undersökningar.

Introduction

Alla biologiska organismer använder elektricitet, i form av joner, för att reglera det cellulära beteendet. Cellmembran innehåller olika typer av specifika jonkanaler som möjliggör passiv och aktiv transport av joner. Dessa joner styr funktionerna i retbara celler, såsom neuronal aktivitet och skelett och hjärt muskel kontraktilitet. Bioelektricitet spelar dock också en viktig roll i icke-retbara celler, som styr många cellulära funktioner såsom cellproliferation¹, neuroimmunity^2,3,4, och stamcellsdifferentiering⁵.

Under de senaste decennierna har området bioelektricitet dragit ett ökande intresse, vilket har bidragit till utvecklingen av ett flertal tekniker för bioelektroniska gränssnitt. Mikroelektrod patch pipetter är guldmyntfoten för intracellulär inspelning och stimulering⁶. I denna metodik dras en glaspipett under särskilda förhållanden för att bilda en skarp kant med en porstorlek på få mikrometer. Denna pipetten är fylld med en buffert och pipetten möjliggör direktkontakt av bufferten med den intracellulära volymen. Detta resulterar i ett bioelektriskt gränssnitt som ger extremt hög signal till brusförhållanden, exakt kontroll över cellulär elektrisk aktivitet och extremt hög temporal upplösning. Även om denna metod är ett extremt kraftfullt verktyg, som nyligen var nedskalad till en nano-pipetkonfiguration⁷, är det förknippat med flera viktiga tekniska begränsningar. Cytosolspädningseffekten⁸, liksom mekaniska vibrationer, begränsar dess nytta till kortfristiga förhör, och det kräver dyr specialiserad utrustning och en hög nivå av teknisk skicklighet. Dessutom begränsar dess skrymmande antalet celler som kan registreras eller stimuleras samtidigt, och på grund av dess invasivitet, det kan inte konfigureras under ett experiment. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades mikroelektroder, men storleken på elektroderna begränsar den rumsliga upplösningen samt intracellulär åtkomst. Nanoelektroderrayer tillåter intracellulär inspelning och stimulering men kräver slipande elektroporation för att komma åt cytosol^9,10. Dessutom är alla dessa metoder substratbundna och är därmed begränsade till in vitro-cellkulturer, eller till externa ytliga celler, utan tillgång till celler som finns inuti en 3-dimensionell (3D) vävnad.

Optogenetics^{11 används} ofta för att ta itu med dessa 3D och in vivo begränsningar. Optogenetiska metoder är dock baserade på de perturbations av ljusaktiverade plasmamembran jonkanaler som distribueras vid plasmamembranet, begränsa 3D spatial upplösning¹² och intracellulära kapacitet.

Vi har nyligen visat att kisel nanotrådar (SiNWs) kan användas för att utföra intracellulära bioelektriska förhör med submicron rumslig upplösning med olika icke-retbara celler, nämligen hjärt myofibroblasts och oligodendrocytes¹³. Dessutom använde vi dessa SiNWs att utföra ex-vivo cell specifika förhör inom en 3D-hjärt vävnad, att undersöka hur hjärtceller elektriskt par in vivo¹⁴. En stor fördel med denna metodik är dess enkelhet; det inte kräver någon genetisk modifiering eller skrymmande instrumentering. Många celler kommer spontant internalisera foto-lyhörda SiNWs med inget behov av ultraljudsbehandling eller elektroporation¹⁵. Dessutom kommer de att spontant fly den endosomala inkapsling och bilda en sömlös integration med cytosol och intracellulära organeller^13,15. Dessa cell-SiNWs kompositer, kallas cell-kisel hybrider, besitter den dynamiska, mjuka och mångsidiga karaktär ursprungliga cellen, liksom optoelektriska kapacitet SiNWs. Efter hybridisering kan cell-SiNW hybrid skördas med hjälp av standard vävnadskultur tekniker och används för olika tillämpningar såsom intracellulära bioelektrisk stimulering; studera intercellulär bioelektrisk koppling in vitro; och för in vivo cell specifika förhör. Som en effektiv stimulering kräver samlokalisering av hög optisk effekt tätheter och SiNWs, kan man uppnå hög rumslig upplösning både i 2D och 3D. I detta protokoll beskriver vi i detalj metodiken, samt hur resultaten kan analyseras. Fokus läggs på den intra- och intercellulära undersökningen in vitro, men in vivo-implementeringen av denna metodik kan direkt utnyttjas för många andra biologiska scenarier.

Protocol

För att säkerställa överensstämmelse med etiska normer godkändes först alla djurprocedurer relaterade till att isolera kardiomyocyter från gnagarehjärtan av University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Dessutom genomfördes alla djurförsök i fullständig enlighet med vägledning från University of Chicago IACUC. 1. Beredning av cell-SiNWs hybrider Isolera primära kardiomyocyter (CMs) med hjälp av en kommersiell kit efter tillverkarens riktlinje…

Representative Results

Förmågan hos denna metodik att tillåta direkt tillgång till den intracellulära cytosolen beror på den spontana internaliseringen av SiNW i cellerna. Även SiNWs kommer att genomgå spontan internalisering i många celltyper15, vissa celler, såsom kardiomyocyter och nervceller, kommer att behöva siNWs som skall behandlas för att deras internalisering19. I detta protokoll vi beskriva internalisering processen för p-i-n SiNWs med 200-300 nm diameter och ~ 1-3 μm lå…

Discussion

Vi har här visat ett enkelt sätt att utföra intracellulär elektrisk stimulering av celler. I denna demonstration använde vi MFs som prehybridized med SiNWs, sedan samkulturerade med CMs. I allmänhet har de flesta prolifereringsceller tendensen att internalisera SiNWs, vilket möjliggör användning av denna metodik med många andra celltyper. Dessutom, medan vi visat den intracellulära stimulering av celler, kan samma principer användas för att utföra extracellulära stimulering av celler. Detta kan göras geno…

Materials

35 mm Glass bottom dishes	Cellvis	D35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal	3i
Calcein-AM	Invitrogen	C1430
CellMask Orange Plasma membrane Stain	Invitrogen	C10045
Collagen I, rat tail	Gibco	A1048301
Deluxe Diamond Scribing Pen	Ted Pella	54468
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine	Gibco	10313039
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Falcon Standard Tissue Culture Dishes	Falcon	08-772E
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,	Gibco	10082147
Fibronectin Human Protein, Plasma	Gibco	33016015
Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific	FB11201
Fluo-4, AM, cell permeant	Invitrogen	F14201
FluoroBrite DMEM Media	Gibco	A1896701
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)	OKO
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit	Thermo Scientific	88281
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056