यहां प्रस्तुत एक प्लेट आधारित, उच्च सामग्री इमेजर का उपयोग करके भ्रूण के विकास के दौरान माइक्रोजेक्ट और साथ ही इमेज मल्टीपल ड्रोसोफिला भ्रूण के लिए एक प्रोटोकॉल है।
मात्रात्मक लाइव सेल इमेजिंग में आधुनिक दृष्टिकोण जैविक प्रक्रियाओं को वर्गीकृत करने और तुलना करने के लिए सांख्यिकी और कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग के उपयोग को सक्षम करके सेल जीव विज्ञान की खोज के लिए एक आवश्यक उपकरण बन गए हैं। यद्यपि सेल संस्कृति मॉडल सिस्टम उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए महान हैं, सेल आकृति विज्ञान के उच्च थ्रूपुट अध्ययन बताते हैं कि पूर्व वीवो संस्कृतियां जीवित जीवों के भीतर कोशिकाओं में पाई जाने वाली रूपात्मक जटिलता को पुनः प्राप्त करने में सीमित हैं। इस प्रकार, एक अक्षुण्ण जीव के भीतर जीवित कोशिकाओं को छवि देने के लिए एक स्केलेबल उच्च थ्रूपुट मॉडल प्रणाली की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित एक उच्च सामग्री छवि विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक साथ सिंकाइटियल ब्लास्टोडर्म चरण के दौरान भ्रूण ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर विकास के कई समय-चूक वीडियो प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। सिंक्टियल ब्लास्टोडर्म ने पारंपरिक रूप से जैविक घटनाओं इमेजिंग के लिए वीवो मॉडल में एक महान के रूप में कार्य किया है; हालांकि, मात्रात्मक और उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोणों के लिए प्रयोगात्मक प्रतिकृति की एक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करना श्रम गहन और प्रयोगात्मक दोहराने के प्रति एक भ्रूण की इमेजिंग द्वारा सीमित किया गया है। यहां प्रस्तुत एक उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम, या स्वचालित मल्टीपॉइंट अधिग्रहण में सक्षम किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप के अनुरूप इमेजिंग और माइक्रोइंजेक्शन दृष्टिकोण को अनुकूलित करने की एक विधि है। यह दृष्टिकोण एक ही इमेजिंग सत्र के भीतर वांछित अधिग्रहण कारकों के आधार पर 6-12 भ्रूण के एक साथ अधिग्रहण को सक्षम बनाता है।
पिछले 30 वर्षों में, इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और लाइव सेल इमेजिंग के लिए आणविक जांच में प्रगति ने कोशिका की जटिलता और आंतरिक कामकाज की हमारी समझ को उन्नत किया है। प्रौद्योगिकी में इस प्रगति के साथ उच्च थ्रूपुट इमेजिंग डेटा के अधिग्रहण के लिए पूर्व वीवो सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग पर अधिक निर्भरता है। सेल कल्चर मॉडल माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के माध्यम से माइक्रोएनवायरमेंट का नियंत्रण और एक साथ कई कोशिकाओं को छवि देने की क्षमता सहित कई फायदे प्रदान करते हैं, जिससे उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग1,2के लिए आवश्यक मात्रात्मक दृष्टिकोणों का उपयोग सक्षम होता है। हालांकि, रूपात्मक अध्ययनों के संदर्भ में सेल संस्कृति मॉडल से जुड़े महत्वपूर्ण नुकसान भी हैं, जैसे कि दो-आयामी ग्लास या प्लास्टिक की सतहें सेल आकृति विज्ञान और इसके विनियमन3,4,5पर भ्रामक प्रभाव पैदा करती हैं। ये प्रभाव सेलुलर आकृति विज्ञान को विनियमित करने वाली जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के संबंध में झूठे या भ्रामक डेटा प्रदान कर सकते हैं।
यद्यपि विकल्प एक अक्षुण्ण जीव6के संदर्भ में सेलुलर आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है, कुछ उपयुक्त अक्षुण्ण जीव पूरे जीवों को इमेजिंग के माध्यम से जीवित रखने में कठिनाइयों के कारण उच्च थ्रूपुट मात्रात्मक लाइव सेल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करते हैं, और एक बड़े बहुकोशिकीय जीव के अंदर इमेजिंग से जुड़ी चुनौतियां। नतीजतन, अक्षुण्ण जीवों में सेल जैविक अध्ययन ने आम तौर पर समय के साथ एक ही जीव को देखने पर ध्यान केंद्रित किया है, जो नमूना आकार को बहुत सीमित करता है। इसके अलावा, यह एक-पशु-एट-ए-टाइम सीमा लाइव इमेजिंग को स्क्रीन के रूप में नियोजित करने के लिए मुश्किल और महंगा बनाती है और मात्रात्मक विश्लेषणात्मक उपकरण लागू करने की क्षमता को प्रतिबंधित करती है क्योंकि नमूनों की संख्या आम तौर पर बहुत छोटी होती है। इस प्रकार, एक बहुकोशिकीय मॉडल जीव की आवश्यकता उत्पन्न होती है जिसका उपयोग उच्च सामग्री आधारित मात्रात्मक दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल मात्रात्मक विश्लेषण के लिए काफी बड़े प्रयोगात्मक नमूना आकार उत्पन्न करने के लिए प्लेट-आधारित उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण को अनुकूलित करता है। ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर को आमतौर पर पहले मॉडल जीव के रूप में जाना जाता है। ड्रोसोफिला का उपयोग करके किए गए शोध से कोशिका और आणविक जीव विज्ञान में सफलताएं मिली हैं, जिनमें आनुवंशिक जानकारी का संचरण, कोशिका संकेत रास्ते की पहचान और भ्रूण विकास की आनुवंशिक आवश्यकताएं7,8, 9शामिल हैं। इसकेअलावा सेलुलर डिवीजन10, 11, 12के दौरान वीवो माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स में एक्सप्लोर करने के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण का इस्तेमाल किया गया है । छोटे अणुओं और आणविक जांच को वितरित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है जो ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास को विशेष रूप से वीवो13,14में सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए शक्तिशाली बनाता है । हालांकि, पारंपरिक इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ प्रयोगात्मक दोहराता की एक महत्वपूर्ण संख्या पैदा करना बेहद श्रम गहन है और उच्च थ्रूपुट इमेजिंग स्क्रीन और मात्रात्मक विश्लेषण में सीमित उपयोग है। हमारा दृष्टिकोण एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करता है जो आमतौर पर एकल सेल विश्लेषण के लिए आरक्षित होता है और शुरुआती ड्रोसोफिला ईएमब्रेओ के सिंक्टियम में वीवो इमेजिंग विश्लेषण में अनुकूलित होता है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोसिस15के दौरान एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में रूपात्मक परिवर्तनों को चलाने वाले तंत्रों का पता लगाने के लिए, मंच और माइक्रोजेक्ट ड्रोसोफिला भ्रूण एकत्र करने के लिए किया गया था। यद्यपि कई अध्ययनों ने कोशिकाचक्र16, 17,18,19केदौरानईआर की गतिशील प्रकृति को रेखांकित किया है, लेकिन ईआर आकृति विज्ञान पर समय भर में कई क्षोभ के प्रभावों की तुलना करना मुश्किल रहा है। कोशिका विभाजन में ईआर आकृति विज्ञान में परिवर्तन करने वाले घटकों की पहचान करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध तरीकों का उपयोग प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में कॉर्टिकल सिंक्टियल डिवीजन का उपयोग करके मिटोटिक ईआर पुनर्गठन पर माइक्रोट्यूबुल और अन्य साइटोस्केलेल कारकों की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। एक साथ लिया, ड्रोसोफिला समुदाय के भीतर आनुवंशिक क्षोभ की उपलब्धता, विकास के दौरान सटीक समय पर दवाओं और आणविक जांच को माइक्रोजेक्ट करने की क्षमता, और ड्रोसोफिला के साथ काम करने की सस्ती लागत इस दृष्टिकोण को उच्च थ्रूपुट छवि-आधारित स्क्रीनिंग के लिए अत्यधिक उत्तरदायी बनाती है। यहां वर्णित विधियां ड्रोसोफिला भ्रूण20का उपयोग करके वीवो में विभिन्न प्रकार की सेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू हैं । विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है जो एक विस्तारित अवधि में और ड्रोसोफिला भ्रूण कॉर्टेक्स के 100 माइक्रोन के भीतर होते हैं।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास में विभिन्न चरणों में जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक बहुमुखी और आसानी से अनुकूलनीय है। यह प्रोटोकॉल लंबे समय तक होने वाली जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। उदाहरण के लिए, सेलुलराइजेशन29, 30या ड्रोसोफिला31 में हेट्रोक्रोमेटिन डोमेन केगठनके अध्ययन,32 इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का उपयोग करने से लाभान्वित हो सकते हैं क्योंकि ये प्रक्रियाएं विस्तारित अवधि में होती हैं। इसके अलावा, नमूना आकार को उन प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए आवर्धन को कम करके बढ़ाया जा सकता है जिन्हें कम ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, जैसे कि सिंक्टियल डिवीजनों33 या गैस्ट्रुलेशन34की अवधि के बीच का समय। इसी तरह, एक 20x उद्देश्य दो भ्रूण के लिए एक इमेजिंग विमान के भीतर छवि के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल में तरीके मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में भ्रूणीय विकास का उपयोग कर जैविक प्रश्न पूछने के लिए एक गतिशील मंच प्रदान करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में 3 महत्वपूर्ण कदम हैं। 50% ब्लीच में पोस्ट डिकेरेशन यह जरूरी है कि भ्रूण को 5 बार (2.3.4) से धोया और सूख जाए। यह कदम कोरियन के किसी भी बचे हुए छोटे टुकड़े को हटा देता है। जब भ्रूण इमेजिंग देखने के क्षेत्र में बाधा डालती है बचा हुआ chorion । जब कांच कवरलिप (३.५) पर भ्रूण बढ़ते, यह एक समान दबाव के साथ गोंद पर भ्रूण प्रेस करने के लिए महत्वपूर्ण है । इससे भ्रूण एक ही जेड प्लेन पर जगह देगा। माइक्रोइंजेक्शन सुई को खोलते समय, सुई के प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए तुरंत प्लंजर को वापस लेना महत्वपूर्ण है या आप अपने सभी इंजेक्टेंट खो देंगे।
हमारा अध्ययन दो कारकों से सीमित था । पहले कारक एक स्वचालित विभाजन प्रक्रिया नहीं था । हमने मैटलैब का उपयोग करके एक मैनुअल सेगमेंटेशन स्क्रिप्ट तैयार की है, हालांकि; एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड स्पिंडल मार्कर के साथ इस प्रक्रिया को स्वचालित किया जा सकता है। भविष्य में हम सीएनएन-आरएफपी21,Rtln1-GFP और सीएनएन-RFP का उत्पादन करना चाहते हैं; स्वचालित धुरी विभाजन को सक्षम करने के लिए ReepB-GFP ट्रांसजेनिक लाइनें। हमारे MATLAB स्क्रिप्ट और विश्लेषण पाइपलाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, Diaz एट अल15की पूरक सामग्री का उल्लेख है । दूसरे, हम भी ३५ एस है, जो केवल हमें एक साथ 6 भ्रूण छवि की अनुमति के हमारे अधिग्रहण अंतराल से सीमित थे । एक लंबा अधिग्रहण अंतराल हमें एक साथ अधिक भ्रूण छवि के लिए अनुमति होगी । हालांकि दवा वितरण थ्रूपुट को माइक्रोइंजेक्शन को पार करने के कदम के साथ बदलकर बढ़ाया जा सकता है, लेकिन हमने पाया कि यह अनावश्यक है क्योंकि हमारे नमूना आकार पहले से ही अधिग्रहण अंतराल तक सीमित था।
जबकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास की छवि के लिए किया गया था, समग्र दृष्टिकोण अन्य बहुकोशिकीय मॉडल प्रणालियों में भ्रूणीय विकास का अध्ययन करने के लिए अनुकूलनीय है, जैसे सी एलिगेंस,सी आशीन, और ज़ेनोपस। भ्रूण मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बेहद उपयोगी होते हैं क्योंकि वे आसानी से संग्रह या निषेचन के माध्यम से सिंक्रोनाइज्ड होते हैं। इसके अलावा, भ्रूण देखने के क्षेत्र से दूर नहीं जाते हैं या तैरते हैं, जिससे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कई बार चूक वीडियो का उत्पादन करने के लिए एक सरल मल्टीपॉइंट अधिग्रहण सक्षम सॉफ्टवेयर का उपयोग सक्षम होता है। यद्यपि हमने अपने अध्ययन में एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग किया, मल्टीपॉइंट अधिग्रहण में सक्षम किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप प्रणाली को यहां उल्के तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है।
इसी तरह के परिणाम एक बहुबिंदु अधिग्रहण सक्षम उल्टे कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, एक उच्च सामग्री विश्लेषक के फायदे उभरने के रूप में एक नमूना आकार बढ़ जाती है सवाल है कि समय में कम संकल्प की आवश्यकता का अध्ययन करने के लिए । एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक स्पष्ट लाभ पारंपरिक प्रणालियों पर 1 स्लाइड की तुलना में एक साथ 4 अलग स्लाइड छवि की क्षमता है । प्रत्येक स्लाइड पर 4 स्लाइड और 40 भ्रूण का एक पूरा सेट के साथ, 160 भ्रूण कई घंटों में छवि की जा सकती है, जब तक अधिग्रहण अंतराल फ्रेम के बीच कम से कम 15 मिनट है। एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक और महत्वपूर्ण लाभ यह है कि नमूनों को किसी भी बाहरी प्रकाश स्रोतों से पूरी तरह से बंद कर दिया जाता है, जो फ्लोरेसेंस तीव्रता-आधारित माप के लिए आवश्यक है। अंत में, हमारे अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उच्च सामग्री विश्लेषक में 5.5 मेगापिक्सल सीएमओएस कैमरा है जो 60x आवर्धन पर उदार 221.87 माइक्रोन क्षेत्र प्रदान करता है। देखने के इस बड़े क्षेत्र ने हमें अधिग्रहण बिंदु के अनुसार आधा भ्रूण छवि के लिए सक्षम बनाया ।
The authors have nothing to disclose.
यूडी, डब्ल्यूएफएम और बीआर को अनुदान समझौते डीबीआई-1548297 के तहत एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र, सेलुलर निर्माण केंद्र द्वारा समर्थित किया जाता है। बीआर को एनएसएफ करियर अवार्ड, 1553695 के माध्यम से भी समर्थन दिया जाता है।
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GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000. | GE healthcare | N/A | A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted. |
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Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting. | Zeiss Microscopy | N/A | The transillumination base and gooseneck lighting are necessary. |