Innsamling av skjelettmuskulaturbiopsier fra Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for mekanisk evaluering

Summary

Denne tekniske rapporten beskriver en variant av den modifiserte Bergström-teknikken for biopsien til musculus tibialis fremre som begrenser fiberskader.

Abstract

De mekaniske egenskapene til å pådra skjelettfibre er avgjørende indikatorer på generell muskelhelse, funksjon og ytelse. Menneskelige skjelettmuskulaturbiopsier samles ofte for disse bestrebelsene. Imidlertid er relativt få tekniske beskrivelser av biopsiprosedyrer, utenfor den vanlige musculus vastus lateralis, tilgjengelig. Selv om biopsiteknikkene ofte justeres for å imøtekomme egenskapene til hver muskel under studier, deler få tekniske rapporter disse endringene i større samfunn. Dermed er muskelvev fra menneskelige deltakere ofte bortkastet som operatøren gjenoppfinner hjulet. Utvide tilgjengelig materiale på biopsier fra en rekke muskler kan redusere hendelsen av mislykkede biopsier. Denne tekniske rapporten beskriver en variant av den modifiserte Bergström-teknikken på musculus tibialis fremre som begrenser fiberskader og gir fiberlengder som er tilstrekkelige for mekanisk evaluering. Operasjonen er en poliklinisk prosedyre som kan fullføres om en time. Gjenopprettingsperioden for denne prosedyren er umiddelbar for lett aktivitet (det vil si turgåing), opptil tre dager for gjenopptakelse av normal fysisk aktivitet, og omtrent en uke for sårbehandling. Det ekstraherte vevet kan brukes til mekaniske krafteksperimenter, og her presenterer vi representative aktiveringsdata. Denne protokollen er egnet for de fleste innsamlingsformål, potensielt tilpasningsdyktig til andre skjelettmuskler, og kan forbedres ved endringer i innsamlingsnålen.

Introduction

Studien av menneskelig muskelfysiologi for kliniske eller forskningsformål krever ofte muskelbiopsier. For eksempel er en stor utfordring i menneskelig muskelfysiologi og biomekanikk å skille mellom og forstå de ulike tilpasningene av muskelytelse til trening. Ytelsestilpasninger inkluderer ikke bare strukturelle tilpasninger (f.eks. endringer i kontraktile proteiner, muskelarkitektur), men inkluderer også nevrale^{tilpasninger 1}, som er svært vanskelig, om ikke umulig, å vurdere separat når du tester intakt in situ menneskelige muskler. Fiber-nivå eksperimenter fjerne disse høyere rekkefølge komponenter og tillate en mer direkte evaluering av muskel sammentrekning og kan samles via biopsi teknikker. Muskelbiopsier har blitt samlet siden minst 1868². I dag er den dominerende teknikken for å samle muskelbiopsier den modifiserte Bergström-teknikken^3,4,5 , selv om andre^teknikkerer tilgjengelige, inkludert bruk av en Weil-Blakesley conchotome⁶ eller den såkalte finnålen^7,8. Alle disse teknikkene bruker spesielle nål-lignende instrumenter som er utformet for å passere inn i muskel og kutte et stykke vev. Spesielt bruker den modifiserte Bergström teknikken en stor modifisert nål (5 mm nålstørrelse her; Figur 1) som har et vindu nær nålespissen og en mindre intern trocar som beveger seg opp og ned nålen, kutte muskelen når du passerer over nål vinduet. Innenfor denne hellige trocar er en ramrod som beveger seg opp og ned i akselen på trocar og skyver biopsien mot nålevinduet. For å trekke muskelen inn i nålevinduet, er en sugeslange festet, noe som suger luft ut av nålen og trekker muskelen inn i nålevinduet via negativt trykk.

Muskelbiopsier er ofte ervervet for å studere endringer i proteininnhold, genuttrykk eller morfologi forårsaket av sykdom eller som svar på et treningsprogram^1,,9,,10,,11. En annen kritisk bruk for muskelbiopsier er mekaniske eksperimenter som måling av fiber kontraktil kraft, muskelfiber stivhet, og historieavhengige muskelegenskaper^{12,13,14,15,16}. Enkeltfiber- eller fiberbuntmekanikk måles ved å feste fibre mellom en lengdemotor og krafttransduser på spesialiserte rigger som styrer fiberlengden samtidig som den måler kraft. Ved å permeabilisere (flå) fibre, blir sarcolemmamembranen gjennomtrengelig for kjemikalier i badeløsningen, noe som åpner for aktiveringskontroll ved varierende kalsiumkonsentrasjon. Videre kan effekten av kontraktile egenskaper på kjemikalier / legemidler / andre proteiner enkelt evalueres ved å legge til det aktuelle reagenset til badeløsningen. Men mens denne teknikken er svært brukt i andre dyremodeller, merkbart færre studier utført mekaniske tester på skinned fibre fra menneskelige muskel biopsier^17,18,19. En grunn er at biopsi verktøy og protokoller er utformet for å fjerne så mye muskelvev som mulig med mindre hensyn til nivået av strukturell skade påført under vev utvinning. Faktisk foreslår en nylig biopsiprotokoll å drive biopsinålen inn i muskelen og samle 2-4 biter av muskel³. Selve prosessen gjør liten skade på DNA eller proteinmateriale, men ødelegger ofte fiber og sarkomeriske strukturer på en slik måte at aktiveringen av muskelfibre blir ustabil eller umulig. Videre er den relative lengden på fibrene i biopsien vanligvis kort (<2 mm) og ikke lett håndteres for mekanisk testing. For mekanisk testing er ideelle fibre lange (3-5 mm) og ikke strukturelt skadet.

Mer avanserte vevsekstraksjonsteknikker kan brukes til å begrense fiberskade. For eksempel benyttet^{en gruppe 20} seg av tidligere planlagte “åpne operasjoner” av underarmer (f.eks. reparasjon av beinbrudd), hvor musklene var fullt eksponert og en kirurg var i stand til å visualisere muskelstrukturen og nøye dissekere relativt store og strukturelt uskadede prøver av muskelvev (15 mm x 5mm x 5 mm). Denne “åpne biopsi” teknikken favoriseres når deltakerne gjennomgår en tidligere planlagt prosedyre, og begrenser derfor bassenget av potensielle deltakere, spesielt for friske voksne, hvor ingen operasjoner ellers ville finne sted. Dermed, mange biopsier utført for forskningsformål er gjort som en poliklinisk prosedyre og snittet området holdes så liten som mulig for å begrense infeksjon risiko, arrdannelse, og healing tid. Derfor samles de fleste biopsier blindt (det vil si at operatøren ikke kan se innsamlingsnålen når den passerer gjennom fasciaen inn i muskelen). Dette innebærer at kvaliteten på biopsien er nesten utelukkende basert på operatørens dyktighet og erfaring. Hver muskel har sine egne vanskeligheter når du samler vev, for eksempel risiko for å bryte nerver og blodkar, valg av en ideell samling dybde og plassering, og bestemmer seg for en passende kroppsposisjon for å holde muskelen så slakk som mulig. Dessverre er de fleste muskelspesifikke ferdigheter ikke skrevet ned, og derfor må hver lege “gjenoppfinne hjulet” når du utfører biopsier på muskler som er nye for dem. Denne mangelen på erfaring fører vanligvis til flere samlinger med lav kvalitet til legen identifiserer de beste praksisene for biopsier på den muskelen. Nybegynnere leger lærer ofte ferdigheten gjennom samtaler med sine mer erfarne kolleger, men relativt få informative og fagfellevurderte tekster eksisterer om saken, spesielt for muskler som ikke tradisjonelt brukes til biopsisamling. Hvis vi vurderer informasjonen ovenfor, sammen med vanskeligheten med å rekruttere menneskelige frivillige til biopsier, er det klart at mer undervisningsinformasjon er nødvendig som maksimerer sjansene for suksess for hver deltaker.

Dermed var formålet med dette papiret å presentere en muskelbiopsiteknikk som gir protokoller for vellykket samling av muskelbiopsier med lange, uskadede fiberfragmenter for mekaniske tester. Menneskelige muskelbiopsier utføres vanligvis på, og mesteparten av biopsitreningsmaterialet er på, musculus vastus lateralis. Dens relativt store muskelstørrelse og overfladiske plassering i forhold til huden gjør det mulig å samling av tilstrekkelig muskelvev, samtidig som pasientens ubehag og fysisk^{traumer 1,21}. Det er imidlertid noen begrensninger for å bruke vastus lateralis for langsgående opplæringsstudier. For eksempel, under eksperimentelle protokoller som inkluderer et treningsprogram, må deltakerne avstå fra ekstra opplæring utenfor studien for en periode som ofte strekker seg over 2-6 måneder. For idrettsutøvere er dette ofte ikke mulig, da vastus lateralis vanligvis trenes under typiske øvelser (f.eks. knebøy, hopp), eller brukes vanligvis til sporten (f.eks. løping, sykling). Disse separate treningserfaringene vekk fra studiens mål kan forårsake muskeltilpasninger som endrer muskelmekanikk, arkitektur og fysiologi på en slik måte at det er vanskelig eller umulig å vite den sanne effekten av studiens eksperimentelle protokoll om muskelegenskaper. For disse typer studier, det ville være ideelt å velge et mål muskel som ofte ikke er fokus for trening regimenter. Den muskulus tibialis fremre (TA) er et ideelt mål muskel som tilfredsstiller kravene ovenfor. I tillegg kan opplæringstiltak målrettes mot TA ved hjelp av kontrollerbare tilnærminger, for eksempel ved bruk av dynamometer. Det er nesten ingen treningsmateriale knyttet til en TA muskelbiopsi. Derfor utviklet vi en modifisert protokoll for å samle relativt uskadede muskelbiopsier fra TA.

Protocol

MERK: Nedenfor skisserer vi en protokoll for å høste mekanisk uskadede fibre fra TA av frivillige som ble registrert i en egen pågående studie. Denne protokollen ligner på den som er beskrevet av Shanely et al.3, som har beskrevet den modifiserte Bergström teknikken i vastus lateralis. Informasjonen som presenteres her har blitt raffinert av vår forskningsgruppe, men er kanskje ikke ideell for alle laboratoriegrupper eller organisasjonsoppsett. Vi gir bare retningslinjer, og sterkt foreslå…

Representative Results

Hele tidsforpliktelsen for en deltaker var omtrent en time (10 min konsultasjon, 10 min ultralyd, 20 min kirurgi forberedelse og bedøvelse administrasjon, 10 min kirurgi, og 10 min utvinning). Ofte, deltakerne ubevisst aktivert sin TA og trengte konsekvente påminnelser for å holde muskelen så avslappet som mulig. Når biopsi nålen var inne i muskelen, deltakerne vanligvis rapportert en unik “trykk” følelse i området rundt biopsi nålen, med sporadiske perioder med moderat til intens ubehag. En gang stoppet en delt…

Discussion

I denne rapporten beskrev vi en teknikk for biopsi av strukturelt uskadet muskelvev fra TA. Vi fant at denne prosedyren gir et akseptabelt innhold av brukbare muskelfibre (5-10 fiber bunt preparater per 50 mg samlet vev) for mekanisk testing. Videre hadde vi nok vev til oppfølgingsmekaniske, genetiske og proteomiske eksperimenter.

Det finnes flere metoder som vanligvis brukes for innsamling av muskelbiopsier^3,,4,,<sup class…

Materials

26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction