Visualisering af Diffusional Dynamics of Gold Nanorods på cellemembran ved hjælp af Single Nanoparticle Darkfield Mikroskopi
Summary
Her viser vi brugen af traditionel mørkfeltmikroskopi til at overvåge dynamikken i guld nanorods (AuNRs) på cellemembran. Placeringen og retningen af enkelte AuNR’er registreres ved hjælp af ImageJ og MATLAB, og auNR’ernes diffusive tilstande er kendetegnet ved enkelt partikelsporingsanalyse.
Abstract
Analyse af nanopartiklers diffusionsdynamik på cellemembran spiller en væsentlig rolle i en bedre forståelse af den cellulære optagelsesproces og giver et teoretisk grundlag for det rationelle design af nanomedicinsk levering. Enkelt partikelsporing (SPT) analyse kunne sonde placeringen og orienteringen af de enkelte nanopartikler på cellemembran, og afsløre deres translationelle og roterende tilstande. Her viser vi, hvordan man bruger traditionel mørkfeltmikroskopi til at overvåge dynamikken i guld nanorods (AuNRs) på levende cellemembran. Vi viser også, hvordan man udtrækker placeringen og orienteringen af AuNR’er ved hjælp af ImageJ og MATLAB, og hvordan man karakteriserer auNR’ernes forskellige tilstande. Statistisk analyse af hundredvis af partikler viser, at enkelte AuNR’er udfører Brownian bevægelse på overfladen af U87 MG cellemembran. Men individuelle lange baneanalyser viser, at AuNR’er har to tydeligt forskellige typer bevægelsestilstande på membranen, nemlig langtrækkende transport og indespærring i begrænset område. Vores SPT-metoder kan potentielt bruges til at studere overfladen eller intracellulær partikelspredning i forskellige biologiske celler og kan blive et kraftfuldt værktøj til undersøgelser af komplekse cellulære mekanismer.
Introduction
Dynamikken i nanopartikler (NPs) på membranen er tæt forbundet med den cellulære optagelsesproces, hvilket er afgørende for forståelsen af cellefunktioner, virale eller bakterielle infektioner og udviklingen af kunstige nanomedicinske leveringssystemer1,2. SPT-teknik (Single Particle Tracking) er et robust værktøj til at karakterisere NPs3,4‘ heterogene adfærd. Generelt er cellemembran flydende, hvilket betyder, at komponenterne som proteiner og lipider kan bevæge sig sideværts i plasmamembranplanet5,6,7. Den spatiotemporale kompleksitet af membran organisation og struktur kan føre til spatiotemporal heterogenitet af samspillet mellem NPs og membran. Derfor kræver direkte visualisering af NPs bevægelse på membranen både høj rumlig og tidsmæssig opløsning.
Enkelt partikelsporing mikroskopi, der overvåger lokaliseringen af individuelle partikler i levende celler med en rumlig opløsning af snesevis af nanometer og en tidsopløsning på millisekunder er blevet veludviklet til at studere NPs eller membranmolekyler dynamik8,9. Fluorescensbaserede mikroskopiske billeddannelsesteknikker er blevet værdifulde værktøjer til observation af NPs/molekyler i levende cellemiljø9,10,11,12. For eksempel, total intern refleksion fluorescens mikroskopi, som billeder tynde lag (~ 100 nm) af prøven på substratet / opløsning interface med en høj spatiotemporal opløsning har været meget udbredt i undersøgelser af membran molekyler dynamik13,14. De iboende ulemper ved enkelte fluorophorer, såsom lav intensitet og hurtig irreversibel fotobleaching, reducerer imidlertid nøjagtigheden og varigheden af sporing13. Derfor har ikke-fluorescerende plasmoniske NPs, som erstatter fluorescerende sonder, tiltrukket mere og mere opmærksomhed i langsigtede billeddiagnostiske undersøgelser på grund af deres unikke optiske egenskaber15. Baseret på spredningssignaler fra plasmoniske NP-sonder er der anvendt flere former for optisk mikroskopiske billeddannelsesteknologier til at studere mekanismen for biologiske processer, såsom mikroskopi i mørke felter (DFM)16, interferometrisk spredning (iSCAT) mikroskopi17 og differentialinterferenskonsekvensmikroskopi (DICM)18. Derudover kan bevægelses- og rotationsdynamikken i AuNR’er opnås ved hjælp af DFM og DICM18,19,20,21,22. I et SPT-eksperiment registreres objektets bevægelse typisk af det optiske mikroskop og analyseres derefter ved SPT-analysemetoder3. De tidsløste baner og orienteringsvinkler, der genereres af individuelle NPs, er normalt stokastiske og heterogene, så det er nødvendigt at præsentere rigelige dynamiske oplysninger med forskellige analysemetoder.
Her leverer vi en integreret protokol, der overvåger dynamikken i AuNR’er på cellemembran ved hjælp af DFM, udtrækker placeringen og orienteringen af AuNR’er med ImageJ og MATLAB og karakteriserer udbredelsen af AuNR’er med SPT-analysemetoder. Som en demonstration viser vi her, hvordan man bruger SPT-protokollen til at visualisere dynamikken i uændrede AuNRs (CTAB-AuNRs, syntetiseret af cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyle som beskyttelsesmiddel) på U87 MG cellemembran. Det er blevet påvist, at CTAB-AuNRs kan adsorbere proteiner i biologisk miljø, bevæge sig på cellemembran og derefter indtaste celler2,20,22. U87 MG-celle er den mest almindelige og mest ondartede tumor i centralnervesystemet, og dens membranreceptorer udtrykkes unormalt. Membranreceptorerne kan interagere med proteiner på AuNR’er, hvilket påvirker auNR’ernes dynamik. Vores protokol gælder generelt for andre SPT-eksperimenter inden for biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol bruges til at studere dynamikken i AuNR’er på cellemembran. Protokollen består af fire dele, herunder mikroskopisk billeddannelse, dataudtræk, dynamisk parameterberegning og dataanalysemetoder, og hver del er fleksibel og universel. Derfor er der mange mulige fremtidige anvendelser, for eksempel at studere flytning af NP-forbundne membranmolekyler på membran, endokytosedynamik af NP-mærkede receptorer, dynamisk analyse af intracellulære NPs og vesikelbelagte NPs transport langs mikrotubul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China med tilskud på 21425519, 91853105 og 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
Referências
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
