Visualisere diffus dynamikk av gull nanorods på cellemembran ved hjelp av enkelt nanopartikkel Darkfield mikroskopi
Summary
Her viser vi bruken av tradisjonell mørkfeltmikroskopi for å overvåke dynamikken i gullnanoroder (AuNRs) på cellemembran. Plasseringen og orienteringen til enkelt AuNRs oppdages ved hjelp av ImageJ og MATLAB, og de diffusive tilstander av AuNRs er preget av enkelt partikkelsporingsanalyse.
Abstract
Analyse av nanopartiklers diffuse dynamikk på cellemembran spiller en betydelig rolle i bedre forståelse av cellulær opptaksprosessen og gir et teoretisk grunnlag for rasjonell design av nanomedisinlevering. Enkelt partikkelsporing (SPT) analyse kan undersøke posisjonen og orienteringen til individuelle nanopartikler på cellemembran, og avsløre deres translasjonelle og rotasjonstilstander. Her viser vi hvordan du bruker tradisjonell mørkfeltmikroskopi for å overvåke dynamikken i gullnanoroder (AuNRs) på levende cellemembran. Vi viser også hvordan du trekker ut plasseringen og orienteringen til AuNRs ved hjelp av ImageJ og MATLAB, og hvordan man karakteriserer de diffusive tilstander av AuNRs. Statistisk analyse av hundrevis av partikler viser at enkelt AuNRs utfører Brownian bevegelse på overflaten av U87 MG cellemembran. Imidlertid viser individuell lang baneanalyse at AuNRs har to forskjellige typer bevegelsesstater på membranen, nemlig langdistansetransport og begrenset områdebegrensning. Våre SPT-metoder kan potensielt brukes til å studere overflaten eller intracellulær partikkeldiffusjon i forskjellige biologiske celler og kan bli et kraftig verktøy for undersøkelser av komplekse cellulære mekanismer.
Introduction
Dynamikken i nanopartikler (NPs) på membranen er nært forbundet med cellulæropptaksprosessen, noe som er avgjørende for forståelsen av cellefunksjoner, virale eller bakterielle infeksjoner og utvikling av kunstige nanomedisinske leveringssystemer1,2. Enkelt partikkelsporing (SPT) teknikk er et robust verktøy for å karakterisere heterogen atferd av NPs3,4. Generelt er cellemembranen fluidisk, noe som betyr at komponentene som proteiner og lipider kan bevege seg sidealt i plasmamembranplan5,6,7. Den spatiotemporale kompleksiteten i membranorganisasjon og struktur kan føre til spatiotemporal heterogenitet av samspillet mellom NPs og membran. Derfor krever direkte visualisering av bevegelsen av NPs på membranen både høy romlig og timelig oppløsning.
Enkeltpartikkelsporing mikroskopi som overvåker lokalisering av individuelle partikler i levende celler med en romlig oppløsning på titalls nanometer og en tidsoppløsning på millisekunder har blitt godt utviklet for å studere NPs eller membranmolekylerdynamikk 8,9. Fluorescensbaserte mikroskopiske bildeteknikker har blitt verdifulle verktøy for å observere NPs / molekyler i levende cellemiljø9,10,11,12. For eksempel har total intern refleksjon fluorescensmikroskopi, som bilder tynne lag (~ 100 nm) av prøven på substratet / løsningsgrensesnittet med høy spatiotemporal oppløsning blitt mye brukt i studier av membranmolekylerdynamikk 13,14. Imidlertid reduserer de iboende ulempene ved enkeltfluoforer, for eksempel lav intensitet og rask irreversibel fotobleaching nøyaktigheten og varigheten av sporing13. Derfor har ikke-fluorescerende plasmoniske NPer, som erstatter fluorescerende sonder, tiltrukket seg mer og mer oppmerksomhet i langsiktige bildestudier på grunn av deres unike optiskeegenskaper 15. Basert på spredningssignalene fra plasmoniske NP-sonder, har flere typer optiske mikroskopiske bildeteknologier blitt brukt til å studere mekanismen for biologiske prosesser, for eksempel mørkfeltmikroskopi (DFM)16, interferometrisk spredning (iSCAT) mikroskopi17 og differensial interferenskontrastmikroskopi (DICM)18. I tillegg kan bevegelses- og rotasjonsdynamikken til AuNRs oppnås ved hjelp av DFM og DICM18,19,20,21,22. I et SPT-eksperiment registreres vanligvis objektets bevegelse av det optiske mikroskopet, og analyseres deretter av SPT-analysemetoder3. De tidsløste banene og orienteringsvinklene som genereres av individuelle NPer, er normalt stokastisk og heterogen, så det er nødvendig å presentere rikelig dynamisk informasjon med ulike analysemetoder.
Her gir vi en integrert protokoll som overvåker dynamikken i AuNRs på cellemembran ved hjelp av DFM, trekker ut plasseringen og orienteringen til AuNRs med ImageJ og MATLAB og karakteriserer spredningen av AuNRs med SPT-analysemetoder. Som en demonstrasjon viser vi her hvordan du bruker SPT-protokollen til å visualisere dynamikken i umodifiserte AuNRs (CTAB-AuNRs, syntetisert av cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyl som beskyttende middel) på U87 MG cellemembran. Det har blitt vist at CTAB-AuNRs kan adsorbere proteiner i biologisk miljø, bevege seg på cellemembran og deretter gåinn i cellene 2,20,22. U87 MG celle er den vanligste og mest ondartede svulsten i sentralnervesystemet, og dets membranreseptorer er unormalt uttrykt. Membranreseptorene kan samhandle med proteiner på AuNRs, som påvirker dynamikken i AuNRs. Vår protokoll gjelder generelt for andre SPT-eksperimenter innen biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte protokollen brukes til å studere dynamikken i AuNRs på cellemembran. Protokollen består av fire deler, inkludert mikroskopisk bildebehandling, datautvinning, beregning av dynamiske parametere og dataanalysemetoder, og hver del er fleksibel og universell. Derfor er det mange mulige fremtidige anvendelser, for eksempel å studere bevegelse av NP-koblede membranmolekyler på membran, endocytose dynamikk av NP-merkede reseptorer, dynamisk analyse av intracellulære NP-er og vesikkelbelagte NP-transport lan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China med tilskuddsnummer på 21425519, 91853105 og 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
Referências
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
