Visualizzazione della dinamica di diffusione dei nanorodi d'oro sulla membrana cellulare utilizzando la microscopia a campo scuro a nanoparticella singola
Summary
Qui, mostriamo l’uso della tradizionale microscopia a campo scuro per monitorare la dinamica delle nanorodi d’oro (AuNR) sulla membrana cellulare. La posizione e l’orientamento dei singoli AuR vengono rilevati utilizzando ImageJ e MATLAB, e gli stati diffusivi degli AuR sono caratterizzati da un’analisi di tracciamento di singole particelle.
Abstract
L’analisi della dinamica di diffusione delle nanoparticelle sulla membrana cellulare gioca un ruolo significativo nella migliore comprensione del processo di assorbimento cellulare e fornisce una base teorica per la progettazione razionale della somministrazione di nano-medicina. L’analisi del single particle tracking (SPT) potrebbe sondare la posizione e l’orientamento delle singole nanoparticelle sulla membrana cellulare, e rivelare i loro stati traslazionali e rotazionali. Qui, mostriamo come usare la tradizionale microscopia a campo scuro per monitorare la dinamica delle nanorodi d’oro (AuNR) sulla membrana cellulare viva. Mostriamo anche come estrarre la posizione e l’orientamento degli AuNAR utilizzando ImageJ e MATLAB e come caratterizzare gli stati diffusivi degli AuNR. L’analisi statistica di centinaia di particelle mostra che i singoli AuRS eseguono il moto browniano sulla superficie della membrana cellulare U87 MG. Tuttavia, l’analisi individuale a traiettoria lunga mostra che gli AuRS hanno due tipi distintamente diversi di stati di movimento sulla membrana, vale a dire il trasporto a lungo raggio e il confinamento ad area limitata. I nostri metodi SPT possono essere potenzialmente utilizzati per studiare la diffusione della superficie o delle particelle intracellulari in diverse cellule biologiche e possono diventare un potente strumento per le indagini su meccanismi cellulari complessi.
Introduction
La dinamica delle nanoparticelle (NP) sulla membrana è strettamente associata al processo di assorbimento cellulare, che è essenziale per la comprensione delle funzioni cellulari, delle infezioni virali o batteriche e dello sviluppo di sistemi artificiali di somministrazione nanomedicale1,2. La tecnica di single particle tracking (SPT) è uno strumento robusto per caratterizzare i comportamenti eterogenei dei PNP3,4. In generale, la membrana cellulare è fluidica, il che significa che i componenti come proteine e lipidi possono muoversi lateralmente nel piano della membranaplasmatica 5,6,7. La complessità spaziotemporale dell’organizzazione e della struttura della membrana può portare all’eterogeneità spaziotemporale dell’interazione tra NP e membrana. Pertanto, la visualizzazione diretta del movimento dei PNP sulla membrana richiede sia un’alta risoluzione spaziale che temporale.
La microscopia a tracciamento di singole particelle che monitora la localizzazione delle singole particelle nelle cellule viventi con una risoluzione spaziale di decine di nanometri e una risoluzione temporale di millisecondi è stata ben sviluppata per studiare la dinamica dei PN o delle molecole di membrana8,9. Le tecniche di imaging microscopico a base di fluorescenza sono diventate strumenti preziosi per osservare np/molecolenell’ambiente delle cellule viventi 9,10,11,12. Ad esempio, la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale, che immagini strati sottili (~100 nm) del campione all’interfaccia substrato/soluzione con un’alta risoluzione spaziotemporale è stata ampiamente utilizzata negli studi sulla dinamica delle molecole di membrana13,14. Tuttavia, gli svantaggi intrinseci dei singoli fluorofori, come la bassa intensità e la rapida fotobleaching irreversibile, riducono l’accuratezza e la durata del tracciamento13. Pertanto, i PNP plasmonici non fluorescenti, che sostituiscono le sonde fluorescenti, hanno attirato sempre più attenzione negli studi di imaging a lungo termine a causa delle loro caratteristiche otticheuniche 15. Sulla base dei segnali di dispersione delle sonde NP plasmoniche, diversi tipi di tecnologie di imaging microscopico ottico sono stati utilizzati per studiare il meccanismo dei processi biologici, come la microscopia a campo scuro (DFM)16,la microscopia a dispersione interferometrica (iSCAT)17 e la microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DICM)18. Inoltre, la dinamica di movimento e rotazione degli AuR può essere ottenuta utilizzando DFM e DICM18,19,20,21,22. Tipicamente, in un esperimento SPT, il movimento dell’oggetto viene registrato dal microscopio ottico, e quindi analizzato dai metodi di analisi SPT3. Le traiettorie risolte nel tempo e gli angoli orientativi generati dai singoli NP sono normalmente stocastico ed eterogeneo, quindi è necessario presentare abbondanti informazioni dinamiche con vari metodi di analisi.
Qui forniamo un protocollo integrato che monitora la dinamica degli AuNR sulla membrana cellulare utilizzando DFM, estrae la posizione e l’orientamento degli AuNR con ImageJ e MATLAB e caratterizza la diffusione degli AuNR con metodi di analisi SPT. Come dimostrazione, mostriamo qui come utilizzare il protocollo SPT per visualizzare la dinamica degli AuNR non modificati (CTAB-AuNRs, sintetizzati dalla molecola di bromuro di ammonio di cetilotrimetilammonio come agente protettivo) sulla membrana cellulare U87 MG. È stato dimostrato che i CTAB-AuNR possono adsorbire le proteine nell’ambiente biologico, muoversi sulla membrana cellulare equindi inserire le cellule 2,20,22. La cellula U87 MG è il tumore più comune e maligno del sistema nervoso centrale e i suoi recettori della membrana sono espressi in modo anomalo. I recettori della membrana possono interagire con le proteine sugli AuNR, che influenzano la dinamica degli AuNR. Il nostro protocollo è generalmente applicabile ad altri esperimenti SPT nel campo della biologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato viene utilizzato per studiare la dinamica degli AuNR sulla membrana cellulare. Il protocollo è composto da quattro parti, tra cui l’imaging microscopico, l’estrazione dei dati, il calcolo dei parametri dinamici e i metodi di analisi dei dati, e ogni parte è flessibile e universale. Pertanto, ci sono molte possibili applicazioni future, ad esempio, studiando il movimento delle molecole di membrana legate all’NP sulla membrana, la dinamica dell’endocitosi dei recettori etichettati NP, l’analisi d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China con numeri di sovvenzione di 21425519, 91853105 e 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
Referências
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