Analyse du réseau α-Actinine dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC à l’aide d’une microscopie de localisation à molécule unique
Summary
La formation d’un réseau de sarcomère approprié est importante pour la maturation des cardiomyocytes dérivés d’iPSC. Nous présentons une approche super résolution qui permet l’évaluation quantitative de la maturation structurelle des cardiomyocytes dérivés de cellules souches, afin d’améliorer les conditions de culture favorisant le développement cardiaque.
Abstract
La maturation des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC est un problème critique pour leur application dans la thérapie régénérative, le dépistage des drogues et la modélisation de la maladie. Malgré le développement de multiples protocoles de différenciation, la génération de cardiomyocytes iPSC ressemblant à un phénotype semblable à un adulte demeure difficile. Un aspect majeur de la maturation des cardiomyocytes implique la formation d’un réseau sarcomère bien organisé pour assurer une grande capacité de contraction. Ici, nous présentons une approche super résolution-basée pour l’analyse semi-quantitative du réseau de α-actinine dans les cardiomyocytes. À l’aide d’une microscopie de localisation photoactivée, une comparaison de la longueur du sarcomère et de l’épaisseur du disque z des cardiomyocytes et des cellules cardiaques dérivés de l’iPSC, isolées du tissu néonatal, a été effectuée. En même temps, nous démontrons l’importance de conditions d’imagerie appropriées pour obtenir des données fiables. Nos résultats montrent que cette méthode est appropriée pour surveiller quantitativement la maturité structurelle des cellules cardiaques à haute résolution spatiale, permettant la détection de changements même subtils de l’organisation du sarcomere.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires (MALADIES cardiovasculaires) telles que l’infarctus du myocarde ou la cardiomyopathie demeurent la principale cause de décès dans le monde occidental1. Comme le cœur humain ne possède qu’une faible capacité de régénération, il est nécessaire de stratégies pour promouvoir la récupération des maladies cardiovasculaires. Cela comprend les thérapies de remplacement cellulaire pour reconstituer les cardiomyocytes perdus (CM), ainsi que le développement de nouveaux médicaments anti-arythmiques pour une intervention pharmaceutique efficace et sûre. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) se sont avérées être une source de cellules prometteuses pour la génération illimitée de CM humain in vitro, adaptée aux thérapies régénératrices, à la modélisation de la maladie, et au développement d’essais de dépistage des médicaments2,3,4.
Bien qu’il existe de nombreux protocoles de différenciation cardiaque différents, cm dérivé de l’iPSC manquent encore certains aspects phénotypiques et fonctionnels qui entravent l’application in vitro et in vivo5,6. À côté des changements électrophysiologiques, métaboliques et moléculaires, le processus de maturation cardiaque implique l’organisation structurelle des sarcomeres, qui sont les unités fondamentales requises pour la génération de force et la contraction cellulaire7. Alors que les CM adultes présentent un appareil contractile bien organisé, les CM dérivés d’iPSC démontrent généralement des filaments de sarcomères désarrangés, associés à une capacité de contraction réduite et à une dynamique de contraction altérée8,9. Contrairement à cm mature qui montrent le modèle de contraction uniaxiale, les structures désorientées dans cm immatures a comme conséquence une contraction radiale de la cellule entière ou favorisent l’apparition des points focaux de contraction9,10.
Pour améliorer la maturation cardiaque, de multiples approches ont été appliquées, y compris les méthodes de culture cellulaire 3D, la stimulation électrique et mécanique, ainsi que l’utilisation de matrices extracellulaires imitant les conditions in vivo11,12,13. Pour évaluer le succès et l’efficacité de ces différentes conditions culturelles, des techniques sont nécessaires pour surveiller et estimer le degré de maturation structurelle de l’iPSC CM, par exemple, par des techniques microscopiques. Contrairement à l’imagerie confocale conventionnelle, la résolution en cas de microscopie de localisation photoactivée (PALM) est environ 10x plus élevée. Cette technique permet à son tour une analyse plus précise, détectant même des altérations subtiles des structures cellulaires14. Compte tenu de la haute résolution de l’imagerie basée sur PALM, l’objectif global de cette méthode était l’évaluation microscopique de la maturité sarcomère dans les CM dérivés d’iPSC par une détermination précise de l’épaisseur du z-Disc et de la longueur du sarcomère. Dans des études antérieures, ces caractéristiques structurelles se sont avérées être des paramètres appropriés pour évaluer la maturité cardiaque15. Par exemple, iPSC-CM malade manquant de dystrophine pleine longueur présentent une longueur de sarcomère réduite et la largeur de la bande z par rapport aux cellules de type sauvage16. De même, la longueur des sarcomeres individuels a été mesurée pour étudier l’impact des signaux topographiques sur le développement cardiaque16. Par conséquent, nous avons appliqué cette approche pour évaluer la maturation structurelle du réseau sarcomère dans iPSC-CM en mesurant quantitativement la longueur du sarcomère et l’épaisseur du disque z.
Protocol
Representative Results
Discussion
La génération de CM in vitro fonctionnel dérivé de l’iPSC est importante pour les thérapies régénératives, la modélisation des maladies et le développement de plates-formes de dépistage des médicaments. Cependant, la maturité insuffisante de ces CM est un obstacle majeur dans la recherche cardiovasculaire20. À cet égard, des techniques d’imagerie à haute résolution sont nécessaires pour permettre la surveillance de l’état de maturation structurale du CM dérivé de l’iPS…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le Fonds structurel de l’UE (FSE/14-BM-A55-0024/18). En outre, H.L. est soutenu par le programme FORUN du Centre médical universitaire de Rostock (889001 et 889003) et la Fondation Josef et Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. est soutenu par le Programme de cliniciens-chercheurs du Centre médical de l’Université Rostock. R.D est soutenu par la DFG (DA1296/6-1), la fondation DAMP, la Fondation allemande du cœur (F/01/12) et la BMBF (VIP+ 00240).
Nous remercions Madeleine Bartsch pour son soutien technique dans la culture cellulaire iPSC et la différenciation cardiaque.
Materials
| human iPSC cell line | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Well Glass Bottom | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml eppendorf tube | Eppendorf | 30121023 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A906 | |
| Cardiomyocyte Dissociation Kit | Stem Cell Technologies | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Cyclooctatetraene | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cysteamine | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Fiji image processing software (Image J) | |||
| Glucose | Carl Roth | X997.2 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 8187150100 | |
| Pyranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| sarcomeric α-actinin antibody [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| sterile water | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689 |
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