A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.
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Artigo de método
Analisando a rede de α-Actinin em Cardiomiócitos derivados do iPSC humano usando microscopia de localização de molécula única
Neste artigo
Resumo
Resumo
A maturação dos cardiomiócitos derivados do iPSC é uma questão crítica para sua aplicação em terapia regenerativa, testes medicamentosos e modelagem de doenças. Apesar do desenvolvimento de protocolos de diferenciação múltiplos, a geração de cardiomiócitos iPSC semelhantes a um fenótipo semelhante a um adulto permanece desafiadora. Um aspecto importante da maturação dos cardiomiócitos envolve a formação de uma rede de sarcomere bem organizada para garantir alta capacidade de contração. Aqui, apresentamos uma abordagem baseada em super resolução para análise semi-quantitativa da rede α-actinina em cardiomiócitos. Utilizando microscopia de localização fotoativada foi realizada uma comparação do comprimento do sarcomere e da espessura do disco z de cardiomiócitos derivados do iPSC e células cardíacas isoladas do tecido neonatal. Ao mesmo tempo, demonstramos a importância das condições adequadas de imagem para obter dados confiáveis. Nossos resultados mostram que este método é adequado para monitorar quantitativamente a maturidade estrutural das células cardíacas com alta resolução espacial, permitindo a detecção de até mesmo alterações sutis da organização sarcomere.
Introdução
Doenças cardiovasculares (DCV) como infarto do miocárdio ou cardiomiopatia continuam sendo a principal causa de morte no mundo ocidental1. Como o coração humano possui apenas baixa capacidade regenerativa, há necessidade de estratégias para promover a recuperação dos DCV. Isso inclui terapias de substituição celular para repor cardiomiócitos perdidos (CM), bem como o desenvolvimento de novos medicamentos anti-arrítmicos para intervenção farmacêutica eficiente e segura. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm se mostrado uma fonte celular promissora para a geração ilimitada de CM humano in vitro, adequado para terapias regenerativas, m....
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Protocolo
Todas as etapas deste protocolo envolvendo camundongos neonatais e adultos foram realizadas de acordo com as diretrizes éticas para o cuidado animal do Centro Médico da Universidade de Rostock.
1. Cultivo e dissociação de cardiomiócitos derivados do iPSC
- Diferencie hiPSC-CMs por 25 dias usando um método de monocamadas 2D, conforme descrito anteriormente17.
- Dissociação pré-inaque de médio a 37 °C e suporte temperatura média a ambiente.
- Lave as células duas vezes com PBS.
- Adicione a dissociação pré-armada de meio às células e incubar por 12 min a 37 °C e 5% de CO2.
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Resultados
Para a estimativa do grau de maturação estrutural de CM, adulto neonatal, adulto totalmente maduro e CM iPSC foram inicialmente rotulados como CM com anticorpo α-actinin para visualizar a rede de sarcomere. Após a aquisição do PALM, as imagens foram reconstruídas e a espessura do disco z foi medida por meio de um software de processamento de imagem baseado em plugin para a detecção automática da largura dos filamentos individuais. O comprimento de Sarcomere foi calculado medindo a distância entre dois picos de intensidad.......
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Discussão
A geração de CM in vitro derivada do iPSC funcional é importante para terapias regenerativas, modelagem de doenças e desenvolvimento de plataformas de rastreamento de medicamentos. No entanto, a maturidade insuficiente desses CM é um grande obstáculo na pesquisa cardiovascular20. Nesse sentido, são necessárias técnicas de imagem de alta resolução que permitam o monitoramento do estado de maturação estrutural do CM derivado do iPSC. Ao mesmo tempo, a microscopia de super resolução pode ser uma ferr.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo Fundo Estrutural da UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Além disso, o H.L. é apoiado pelo Programa FORUN do Centro Médico da Universidade de Rostock (889001 e 889003) e pela Fundação Josef e Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. é apoiado pelo Programa de Cientistas Clínicos do Centro Médico da Universidade de Rostock. A R.D é apoiada pelo DFG (DA1296/6-1), pela fundação DAMP, pela Fundação Alemã do Coração (F/01/12) e pela BMBF (VIP+ 00240).
Agradecemos a Madeleine Bartsch por seu apoio técnico na cultura celular iPSC e diferenciação cardíaca.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| linha celular humana iPSC | Takara | Y00325 | |
| µ-Slide 8 Poço Fundo de Vidro | ibidi | 80827 | |
| 0.5ml tubo eppendorf Eppendorf | 30121023 | ||
| Albumina de soro bovino | Sigma Aldrich | A906 | |
| Kit de Dissociação de Cardiomiócitos | Tecnologias de Células-Tronco | 05025 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40-1G | |
| Ciclooctatetraeno | Sigma Aldrich | 138924-1G | |
| Cisteamina | Sigma Aldrich | 30070-10g | |
| salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem Ca2+ e Mg2+ | Thermo Fisher | 14190169 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21237 | |
| Software de processamento de imagem Fiji (Imagem J) | |||
| Glicose | Carl Roth | X997.2 | |
| Ácido clorídrico | Sigma Aldrich | H1758 | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 sistema | Zeiss | ||
| Paraformaldeído | Merck | 8187150100 | |
| Piranose oxidase | Sigma Aldrich | P4234-250UN | |
| anticorpo sarcômrico de &alfa;-actinina [EA-53] | Abcam | ab9465 | |
| Cloreto de sódio | Sigma Aldrich | S7653 | |
| água estéril | Carl Roth | 3255.1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Base Trizma | Sigma | Aldrich T1503 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma Aldrich | Nº 63689 |
Referências
- McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H.
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Reimpressões e permissões
