Analysera α-Actinin Network i mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter med hjälp av single molecule lokaliseringsmikroskopi

Summary

Bildandet av en ordentlig sarkomer nätverk är viktigt för mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter. Vi presenterar en super resolution-baserade strategi som möjliggör kvantitativ utvärdering av den strukturella mognaden av stamceller härledda kardiomyocyter, att förbättra kultur villkor främja hjärt utveckling.

Abstract

Mognaden av iPSC-härledda kardiomyocyter är en kritisk fråga för deras tillämpning i regenerativ terapi, drogtester och sjukdom modellering. Trots utvecklingen av flera differentiering protokoll, är generationen av iPSC kardiomyocyter som liknar en vuxen-liknande fenotyp fortfarande utmanande. En viktig aspekt av kardiomyocyter mognad innebär bildandet av en välorganiserad sarkomere nätverk för att säkerställa hög kontraktion kapacitet. Här presenterar vi en super resolution-baserad strategi för semi-kvantitativ analys av α-aktinin nätverk i kardiomyocyter. Använda photoactivated lokalisering mikroskopi en jämförelse av sarcomere längd och z-skiva tjocklek av iPSC-härledda kardiomyocyter och hjärt celler isolerade från neonatal vävnad utfördes. Samtidigt visar vi vikten av korrekt bildframställning villkor för att få tillförlitliga uppgifter. Våra resultat visar att denna metod är lämplig att kvantitativt övervaka den strukturella mognad hjärtceller med hög rumslig upplösning, möjliggör detektering av även subtila förändringar av sarkomere organisation.

Introduction

Hjärt-kärlsjukdomar (CVD) såsom hjärtinfarkt eller kardiomyopati förblir den främsta dödsorsaken i västvärlden¹. Eftersom det mänskliga hjärtat bara besitter dålig regenerativ kapacitet, finns det ett behov av strategier för att främja återhämtningen från cvds. Detta inkluderar cell ersättningsterapier för att fylla förlorade kardiomyocyter (CM), samt utveckling av nya anti-arytmiska läkemedel för effektiv och säker farmaceutisk intervention. Inducerad pluripotent stamceller (iPSC) har visat sig vara en lovande cellkälla för obegränsad generation av mänskliga CM in vitro, lämplig för regenerativa terapier, sjukdom modellering, och för utveckling av läkemedelsscreening analyser^2,3,4.

Även om många olika protokoll för hjärtdifferentiering finns saknar iPSC-härledda CM fortfarande vissa fenotypiska och funktionella aspekter som hindrar in vitro- och in vivo-tillämpningen^5,6. Bredvid elektrophysiologic, metaboliska, och molekylära förändringar, hjärtmognad processen innebär den strukturella organisationen av sarkomerer, som är de grundläggande enheter som krävs för kraft generation och cell kontraktion⁷. Medan vuxna CMs uppvisar en välorganiserad kontraktil apparat, iPSC-härledda CMs visar ofta disarranged sarcomere glödtrådar, i samband med en minskad kontraktion förmåga och förändrad kontraktion^{dynamik 8,9}. I motsats till mogna CM som visar uniaxial kontraktion mönster, de desorienterade strukturer i omogna CM resulterar i en radiell sammandragning av hela cellen eller främja uppkomsten av kontraktion kontaktpunkter^9,10.

För att förbättra hjärtmognad har flera tillvägagångssätt tillämpats, inklusive 3D-cellodlingsmetoder, elektrisk och mekanisk stimulering, samt användning av extracellulära matriser som härmar i vivo-förhållanden^11,12,13. För att utvärdera framgång och effektivitet av dessa olika odlingsförhållanden behövs tekniker för att övervaka och uppskatta graden av den strukturella mognaden av iPSC CM, t.ex. I motsats till konventionella confocal imaging, upplösningen vid fotoaktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) är ungefär 10x högre. Denna teknik i sin tur möjliggör en mer exakt analys, upptäcka även subtila förändringar av cellulära strukturer¹⁴. Med tanke på den höga upplösningen av PALM-baserade bildåtergivning, det övergripande målet för denna metod var den mikroskopiska utvärderingen av sarcomere mognad i iPSC-härledda CMs genom exakt bestämning av z-Disc tjocklek och sarcomere längd. I tidigare studier har dessa strukturella funktioner visat sig vara lämpliga parametrar för att bedöma hjärtmognad¹⁵. Till exempel, sjuka iPSC-CM saknar full längd dystrofin uppvisar minskad sarkomere längd och z-band bredd när man jämför med vilda typ celler¹⁶. Likaså var längden på enskilda sarkomeres mätt för att undersöka effekterna av topografiska ledtrådar på hjärtutveckling¹⁶. Därav tillämpade vi detta tillvägagångssätt för att utvärdera den strukturella mognaden av sarkomere nätverket i iPSC-CM genom att kvantitativt mäta sarkomlängd och z-skiva tjocklek.

Protocol

Alla steg i detta protokoll som involverar neonatal och vuxna möss utfördes enligt de etiska riktlinjerna för djurvård av Rostock University Medical Centre. 1. Odling och dissociation av iPSC-härledda kardiomyocyter Differentiera hiPSC-CMs för 25 dagar med en 2D monolayer metod som beskrivs tidigare17. Prewarm dissociation medium till 37 °C och stöd medelhög till rumstemperatur. Tvätta celler två gånger med PBS. Tills?…

Representative Results

För uppskattning av graden av strukturell mognad av CM, neonatal, fullt mogen vuxen och iPSC CM var ursprungligen märkt CM med α-aktinin antikropp för att visualisera sarcomere nätverket. Efter PALM förvärv, var bilder rekonstrueras, och z-skiva tjocklek mättes med hjälp av plugin-baserade bildbehandling programvara för automatisk upptäckt av bredden av enskilda glödtrådar. Sarcomere längd beräknades genom att mäta avståndet mellan två intilliggande intensitet toppar, motsvarande angränsande glödtråd…

Discussion

Genereringen av funktionella iPSC-härledda CM in vitro är viktigt för regenerativa terapier, sjukdomsmodellering och utveckling av läkemedels-screening plattformar. Men otillräcklig mognad av dessa CM är ett stort hinder i kardiovaskulär^{forskning 20}. I detta avseende behövs högupplösta avbildningstekniker som möjliggör övervakning av det strukturella mognadstillståndet för iPSC-härledda CM. Samtidigt kan super upplösning mikroskopi vara ett värdefullt verktyg för att exakt analy…

Materials

human iPSC cell line	Takara	Y00325
µ-Slide 8 Well Glass Bottom	ibidi	80827
0.5ml eppendorf tube	Eppendorf	30121023
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A906
Cardiomyocyte Dissociation Kit	Stem Cell Technologies	05025
Catalase	Sigma Aldrich	C40-1G
Cyclooctatetraene	Sigma Aldrich	138924-1G
Cysteamine	Sigma Aldrich	30070-10g
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher	14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21237
Fiji image processing software (Image J)
Glucose	Carl Roth	X997.2
Hydrochloric acid	Sigma Aldrich	H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Paraformaldehyde	Merck	8187150100
Pyranose oxidase	Sigma Aldrich	P4234-250UN
sarcomeric α-actinin antibody [EA-53]	Abcam	ab9465
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S7653
sterile water	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	63689