Denne protokol præsenterer en 3D biomimetisk model med tilhørende fibrotisk stromal rum. Tilberedt med fysiologisk relevante hydrogels i nøgletal efterligner de bio-fysiske egenskaber af den stromale ekstracellulære matrix, en aktiv mægler af cellulære interaktioner, tumorvækst og metastaser.
Hepatocellulær carcinom (HCC) er en primær levertumor udvikler sig i kølvandet på kronisk leversygdom. Kronisk leversygdom og betændelse fører til et fibrotisk miljø aktivt støtte og kørsel hepatocarcinogenesis. Indsigt i hepatocarcinogenese i form af samspillet mellem tumor stroma mikro-miljø og tumorceller er således af stor betydning. Tredimensionelle (3D) cellekulturmodeller foreslås som den manglende forbindelse mellem nuværende in vitro 2D-cellekulturmodeller og in vivo-dyremodeller. Vores mål var at designe en ny 3D biomimetisk HCC-model med tilhørende fibrotisk stromal rum og vaskulatur. Fysiologisk relevante hydrogels såsom kollagen og fibrinogen blev indarbejdet for at efterligne de bio-fysiske egenskaber af tumorEN ECM. I denne model LX2 og HepG2 celler indlejret i en hydrogel matrix blev seedet på den omvendte transmembrane indsætte. HUVEC celler blev derefter seedet på den modsatte side af membranen. Tre formuleringer bestående af ECM-hydrogels indlejret med celler blev udarbejdet, og de bio-fysiske egenskaber blev bestemt af rheologi. Celle levedygtighed blev bestemt af en celle levedygtighed assay over 21 dage. Effekten af det kemoterapeutiske lægemiddel doxorubicin blev evalueret i både 2D-co-kultur og vores 3D-model i en periode på 72 timer. Rheologi resultater viser, at bio-fysiske egenskaber af en fibrotisk, cirrhotic og HCC leveren med succes kan efterlignes. Samlet set viser resultaterne, at denne 3D-model er mere repræsentativ for in vivo-situationen sammenlignet med traditionelle 2D-kulturer. Vores 3D tumor model viste en nedsat reaktion på kemoterapeutik, efterligne resistens typisk ses hos HCC patienter.
Hepatocellulær carcinom (HCC) omfatter 90% af alle primære leverkræft1,2. Med 810.000 dødsfald og 854.000 nye tilfælde rapporteret årligt er det i øjeblikket rangeret som den femte mest almindelige kræft på verdensplan med en af de højeste forekomster afdødelighed 1. Udviklingen af HCC tilskrives overvejende betændelse forbundet med kroniske leversygdomme, nemlig viral hepatitis, kronisk overdreven alkoholindtag, metabolisk syndrom, fedme og diabetes1,3,4. Betændelsen forbundet med disse patologiske tilstande resulterer i hepatocytskade og sekretion af forskellige cytokiner, der aktiverer og rekrutterer hepatisk stjerneceller og inflammatoriske celler til at indlede fibrose5. Hepatisk stellate celler er kendt for deres centrale rolle i indledningen, progression, og regression af leverfibrose. Ved aktivering differentierer de sig til myofibroblast som celler med kontraktile, proinflammatoriske og pro-fibrinogene egenskaber6,7,8. Den resulterende fibrose forårsager igen dysregulering af ekstracellulær matrix remodeling enzymaktivitet, hvilket skaber et miljø præget af en samlet øget stivhed ledsaget af udskillelsen af vækstfaktorer, hvilket yderligere bidrager til HCC patogenese9,10. Det er denne kontinuerlige patogene feedback loop mellem hepatocytter og det stromale miljø, som brændstoffer kræft indledning, epitel til mesenchymale overgange (EMT), angiogenese, metastatisk potentiale, og ændret lægemiddelrespons11,12,13. Indsigt i hepatocarcinogenese med hensyn til samspillet mellem tumoren og tumormikromiljøet er derfor af stor betydning ikke kun fra et mekanistisk, men også fra et behandlingsperspektiv.
To-dimensionelle (2D) in vitro cellekultur modeller er overvejende anvendes af 80% af kræft celle biologer14. Disse modeller er dog ikke repræsentative for det sande tumormikromiljø, som påvirker kemoterapeutiske reaktioner14,15,16. I øjeblikket 96% af kemoterapeutiske lægemidler mislykkes under kliniske forsøg14. Denne høje forekomst i narkotikaslidningsrater kan tilskrives det faktum, at tilgængelige in vitro-forscreeningsmodeller ikke fuldt ud repræsenterer vores nuværende indsigt og forståelse af HCC’s kompleksitet og mikromiljøet16. Omvendt in vivo dyremodeller til stede med kompromitteret immunforsvar og forskelle i samspillet mellem tumor og mikromiljøet i forhold til mennesker16,17. I gennemsnit kan kun 8 % af resultaterne fra dyreforsøg oversættes pålideligt fra præklinisk til klinisk indstilling16,17. Derfor er det klart, at evalueringen af HCC kræver udvikling af en in vitro-platform, der effektivt opsummerer kompleksiteten af ikke kun tumoren, men også mikromiljøet. Platformene vil supplere de aktuelt tilgængelige in vitro prækliniske screeningmodeller og reducere mængden af dyreforsøg i fremtiden7,14.
En sådan platform er avancerede tredimensionelle (3D) cellekulturmodeller. Et væld af disse avancerede 3D-modeller til at studere HCC er opstået i løbet af det sidste årti, og forskellige anmeldelser er blevet offentliggjort. Tilgængelige 3D-modeller til undersøgelse af HCC omfatter flercellede sfæroider, organoider, stilladsbaserede modeller, hydrogels, mikrofluidics og biotryk. Af disse er flercellede sfæroider en af de mest kendte modeller, der anvendes i studiet af tumorudvikling. Spheroids er en billig model med lave tekniske vanskeligheder, mens de samtidig effektivt efterligner in vivo tumorarkitektur18,19,20. Multicellulære sfæroider har bidraget til et væld af oplysninger om HCC17,21,22. Men, standardiseret kultur tid mangler som multicellulære sfæroider holdes i kultur mellem 7 til 48 dage. Øget kulturtid er af stor betydning. Eilenberger fandt, at forskellene i sfæroid alder dybt påvirker Sorafenib (en kinase hæmmer, der anvendes til behandling af leverkræft) diffusitet ogtoksicitet 23. Mens Wrzesinski og Fey fandt, at 3D hepatocyt sfæroider kræver 18 dage at genetablere vigtige fysiologiske leverfunktioner efter trypsinisering og fortsætter med at udvise den stabile funktionalitet i op til 24 dage efter denne genopretning24,25.
Nogle af de mere avancerede 3D HCC-modeller omfatter brugen af humane decellulariserede leverstilladser og biotrykte stilladser. Mazza og kolleger skabte et naturligt 3D stillads til HCC-modellering ved hjælp af decellulariserede humane lever, der ikke er egnede til transplantation26. Disse naturlige stilladser kunne med succes genbefolkes i 21 dage med en co-kultur af lever stellate og hepatoblastoma celler, samtidig med at udtrykket af centrale ekstracellulære matrix komponenter såsom kollagen type I, III, IV og fibronectin. Bortset fra sygdomsmodellering giver denne model også fordelen ved funktionel organtransplantation og præklinisk lægemiddel- og toksicitetsscreening26. Med fremskridt inden for 3D-biotryk kan 3D-ekstracellulære matrixstilladser nu også biotrykkes. Ma og kolleger, biotrykte ekstracellulære matrixstilladser med variable mekaniske egenskaber og biomimetisk mikroarkitektur ved hjælp af hydrogelingeniør fra decellulariseret ekstracellulær matrix27. Utvivlsomt disse er alle fremragende 3D HCC modeller. Men, utilgængelighed af menneskelige lever og de omkostninger, der er forbundet med at erhverve det nødvendige udstyr og materialer placerer disse modeller i en ulempe. Derudover er disse metoder alle teknisk avancerede, hvilket kræver omfattende uddannelse, som måske ikke er let tilgængelige for alle forskere.
Baseret på kompleksiteten af HCC og i øjeblikket tilgængelige 3D-modeller, vi forsøgte at udvikle en altomfattende 3D HCC model. Vi sigtede mod en model, der er i stand til at opsummere både det præmalignante og tumormikromiljø ved at inkorporere justerbare hydrogelstivhedsværdier. Desuden har vi også inkluderet hepatocellulære og stroma tilknyttede cellelinjer, der spiller en central rolle i patogenese af HCC. Disse omfatter endotelceller, leverinde stellate celler og ondartede hepatocytter, dyrket i et mikromiljø bestående af fysiologisk relevante hydrogels. Med de valgte hydrogels, kollagen type I og fibrinogen, indarbejdet i nøgletal, der kan sammenlignes med bio-fysiske ændringer set i leverstivhed under påbegyndelsen og progressionen af HCC. Derudover sigtede vi mod en model, der kunne holdes i kultur i en længere periode. Vi forestillede os en modulær, omkostningseffektiv model, der kan sættes op med grundlæggende udstyr, minimal træning og erfaring og let tilgængelige materialer.
I denne protokol beskrives udviklingen af en metode til oprettelse af en biomimetisk model til HCC. Der er etableret en klar arbejdsgang, og de kritiske trin, der er involveret, er identificeret. Disse kritiske trin omfatter forberedelse af fibrinogenbestandsopløsningen, belægning af indsatserne med kollagen og såning af cellerne indlejret i hydrogelen. Under forberedelsen af fibrinogenbestandsopløsningen er det vigtigt at tilføje fibrinogen i mindre trin ved højere koncentrationer. Dette vil ikke blot reducere den tid, det tager for fibrinogen at opløse, men vil også forhindre fibrinogen i at gelere inkonsekvent og for tidligt som det ses i figur 11. Forberedelsen af fibrinogengelen tager lang tid, og dette kan påvirke den samlede eksperimentelle succes. Resultaterne viser, at når fibrinogen gel begynder at gel inkonsekvent er det bedst at kassere det. Indsatserne skal belægges med kollagen, vaskes med PBS og tørres i laminar flow hætten, før såning cellerne indlejret i hydrogels. Hvis det ikke sikres, at indsatsen er tør, vil hydrogelerne løbe ud over skærets kanter, hvilket resulterer i en ujævn gel. Ujævnhed af gelen vil i sidste ende påvirke resultaterne, hvor diffusion er en faktor.
Figur 11: Fremstilling af fibrinogengel til fibrinogen/kollagenhydrogelformuleringer. (A) Fibrinogen gelopløsning, der har dannet klumper og begyndte at gel for tidligt med uopløst fibrinogen klæber til røret. (B) Fibrinogen gelopløsning, der er opløst fuldstændigt, opløsningen er klar og lidt mere tyktflydende. Klik her for at se en større version af dette tal.
Det anbefales at arbejde så hurtigt som muligt, mens du sår hydrogelcelleaffjedringen på indsatserne, da fibrinogenkomponenten begynder at krydse med tilsætningen af thrombin. Forbered mindre arbejdsvolumener på et tidspunkt, hvor der arbejdes med gelaffjedringer ved højere koncentrationer for at forhindre gelen i at krydslinke under såning. Sidstnævnte vil have en effekt på fordelingen og mængden af gel seedet på hver brønd. Rækkefølgen af tilføjelse af komponenterne er kritisk, i denne protokol leverede vi en strømlinet arbejdsgang for at forhindre geler i at krydslinke for tidligt. På grund af viskositeten af hydrogelgelgelaffjedringen anbefales det at arbejde med en skåret pipettespids under blanding og måling. Ved blanding af suspensionen sikre, at dette gøres hurtigt og jævnt for at skabe en homogen suspension. Ujævn blanding vil resultere i en heterogen gel, som vil påvirke resultaterne negativt, se figur 12.
Figur 12: Kollagen/fibrinogen geler seedet på 12 brøndplader. Alle geler, der er seedet i et volumen på 200 μL, der indeholder 2 mg/mL kollagen og 20 mg/mL Fibrinogen med 2,0 x 106 celler/mL. (A) Hydrogelgel med heterogen konsistens, synlig ujævn fordeling af hydrogelerne. (B) Hydrogels homogent blandet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter protokoloptimeringen blev modellen evalueret for at bestemme modellernes bio-fysiske egenskaber. Rheologidata viste, at vores model, der består af fysiologisk relevante ekstracellulære matrixkomponenter, nemlig kollagentype I og fibrinogen, var i stand til at efterligne de bio-fysiske egenskaber ved en fibrotisk, cirrhotisk og HCC-lever28,29,30,31,32. Rekapitulere leverstivhed i 3D-modeller for HCC er af stor betydning og overses ofte under modeludvikling. Øget leverstivhed er relateret til kemoterapeutisk resistens, spredning, migration og dvale inden for I HCC38. Mens aktiveringen af lever stellate celler i HCC er forbundet med øget ekstracellulær matrix stivhed, med flere signalering veje forbundet med disse lever stjernernes celler viser mekanosensitivitet39.
Inddragelsen af stroma associerede celler såsom lever stellate celler og endotelcelle i udviklingen af 3D-modeller til HCC er blevet mere og mere relevant. Undersøgelser viser, at multicellulære sfæroider bestående af lever stellate og HCC celler resulterede i øget kemoterapeutisk resistens og invasiv migration, mens efterligne HCC tumor udseende in vivo, sammenlignet med en PXT mus model og humane HCC vævsprøver17. En lignende undersøgelse foretaget af Jung et al., 2017 fandt multicellulære sfæroide bestående af hepatocellulær carcinom (Huh-7) og endotelceller (HUVEC) fremmet vaskularisering og aggressivitet22. Disse sfæroider viste levedygtighed ved betydeligt højere koncentrationer af doxorubicin og sorafenib sammenlignet med Huh-7 monokultur sfæroider22. Evalueringen af vores models levedygtighed og reaktion på doxorubicin, med stivhedsværdier svarende til HCC’s og inddragelsen af stromarelaterede celler (LX2 og HUVEC), viste et lignende faldt som reaktion på kemoterapeutik sammenlignet med en 2D-cokulturmodel. Således effektivt efterligne resistens over for lægemidler typisk ses hos patienter og andre 3D HCC modeller.
Da dette er et modulært system modellen kan befæstes ved tilsætning af andre ekstracellulære matrix komponenter nemlig, laminin og hyaluronsyre. Alternativt kan de nuværende hydrogeler, der anvendes inden for denne model, erstattes af syntetiske hydrogeler som natriumalginat eller chitosan. Yderligere ændringer af den nuværende model kan være udskiftning af cellelinjerne med primære cellekulturer for at producere en endnu mere fysiologisk relevant model eller ved hjælp af kombinationer af andre tumor- og stromalcellelinjer.
Vi har således med succes udviklet en 3D-model med tunable bio-fysiske egenskaber til at studere tumor-stroma interaktioner i HCC. Vi har fundet vores model til at være mere repræsentativ for in vivo situationen i forhold til traditionelle 2D kulturer som reaktion på doxorubicin. Der er dog stadig meget at gøre, vi håber at kunne karakterisere denne model udførligt og udforske modellen som en mulig metastatisk platform til at besvare mere komplekse og presserende spørgsmål, der forbliver i undersøgelsen HCC.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret gennem tilskud fra Kræftfonden, Can2017/518, det svenske selskab for medicinsk forskning (SSMF, S17-0092), O.E. och Edla Johanssons fonden og Olga Jönssons fonden. Disse finansieringskilder var ikke involveret i udformningen af undersøgelsen; indsamling, analyse og fortolkning af data udarbejdelse af rapporten og i beslutningen om at forelægge artiklen til offentliggørelse. 3D-print af specialdesignede afstandsstykke, der anvendes i denne protokol blev udført på U-PRINT: Uppsala University’s 3D-print facilitet på disciplinære domæne medicin og apotek, U-PRINT@mcb.uu.se. Vi vil gerne takke Paul O’Callaghan for hans værdifulde input til vores projekt.
AlamarBlue (Resazurin sodium salt) | Sigma | 211-500 | Prepare according to manufacturesr recommendations |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma | A5955-100ML | |
Aprotinin Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78432 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-2.5KG | Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% |
CO2 Incubator | Kebo Biomed Sweden | ||
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate | Sigma | CLS3904-100EA | |
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports | Sigma | CLS3396-2EA | HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs |
Discovery Hybrid Rheometer 2 | TA instruments, Sollentuna, Sweden | ||
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells) | Thermo Fisher Scientific | 61965059 | Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution |
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC) | Cell Applications, Inc | 211-500 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand | Thermo Fisher Scientific | A3160902 | |
Fibrinogen type I-S from bovine plasma | Sigma | F8630-10G | |
FLUOstar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
Hanks' balanced salt solution | Sigma | H9394-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate |
Labogene scanspeed 416 centrifuge | Labogene, Sweden | ||
Laminar flow hood | Kebo Biomed Sweden | ||
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance | Mettler Toledo | ||
Nikon TMS Light microscope | Nikon, Japan | ||
Phosphate buffered saline tablet | Sigma | P4417-100TAB | Prepare according to manufacturers recommendation |
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL | Ibidi | 50201 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Merck | B619298 | |
TC20 Automated cell counter | BioRad | ||
TC20 cell counter counting slides | BioRad | ||
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5) |
Trypsin (2.5%) 10x | Thermo Fisher Scientific | Dilute to 1x in PBS | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T6414-100ML | Solution, sterile-filtered |